細菌纖維素高產(chǎn)菌株的篩選和初步鑒定

摘要：通過靜置富集和分離純化等步驟從自然腐爛的水果中分離得到6株產(chǎn)細菌纖維素的菌株。從腐爛的芒果中篩選得到1株可產(chǎn)細菌纖維素的混合菌，混合菌產(chǎn)量為濕重617.3 g/L、干重23.9 g/L。經(jīng)過分離純化確定該混合菌中只有1株產(chǎn)細菌纖維素菌株M7，在傳代培養(yǎng)過程中M7菌株細菌纖維素產(chǎn)量最高且穩(wěn)定。對M7菌株進行形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA分子序列分析，初步確定M7菌株為葡糖醋桿菌，16S rDNA分子序列已提交至GenBank，序列號為JX303335。

關(guān)鍵詞：細菌纖維素；篩選；鑒定；葡糖醋桿菌屬

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3514-04

纖維素是自然界中含量最多的生物聚合物。植物纖維素含有半纖維素、木質(zhì)素、果膠等雜質(zhì)而影響了其使用的廣泛性，工業(yè)上為了去除細胞壁中的木質(zhì)素以獲得纖維素，需要應(yīng)用對環(huán)境有害的化學物質(zhì)并且只能得到植物中50%的纖維素[1]。細菌纖維素是在1886年被首次報道的，它是由細菌產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)特點和力學特性不同于植物纖維素的純度很高的纖維素[2]，它的優(yōu)良特性彌補了植物纖維素的不足之處。細菌纖維素是由微生物合成的一種生物納米材料，與植物纖維素相比，具有獨特的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和超細、純度高、結(jié)晶度高、與水結(jié)合能力強和機械性能優(yōu)良等特點，成功應(yīng)用于很多領(lǐng)域，是當今國內(nèi)外生物材料研究的熱點之一[3]。由微生物產(chǎn)生的細菌纖維素產(chǎn)量低且生產(chǎn)成本高，很難應(yīng)用于工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)，因此篩選出一種高產(chǎn)量的菌株至關(guān)重要。本試驗以自然腐爛的水果為原料，篩選得到1株高產(chǎn)菌株M7，經(jīng)過對M7菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA分子序列分析初步鑒定為葡糖醋桿菌屬。根據(jù)前人所做的研究結(jié)果[4，5]，本試驗將菌株培養(yǎng)條件設(shè)置為30 ℃培養(yǎng)，pH 6.0，碳源為蔗糖。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

VS-1300潔凈工作臺、SPX-250-Z型生化培養(yǎng)箱、HVE-50全自動滅菌器、VITEK-32全自動微生物鑒定儀、Bio-rad iCycler梯度PCR儀、G-130XHR凝膠成像系統(tǒng)、Eppendorf 5810R冷凍離心機、DM2500和DM4200顯微鏡、TIANGEN瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒等。

1.2 試驗材料

1.2.1 菌種來源 芒果等19種自然腐爛的水果。

1.2.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（W/V）：5%蔗糖，0.5%酵母浸出粉，0.5%蛋白胨，0.5% K2HPO4·3H2O，0.5% Na2HPO4·12H2O，0.1%檸檬酸（C6H8O2·H2O），0.025% MgSO4·7H2O，pH 6.0；固體分離培養(yǎng)基（W/V）：3%蔗糖，0.5%酵母浸出粉，0.5%蛋白胨，0.5% K2HPO4·3H2O，0.5% Na2HPO4·12H2O，0.1%檸檬酸（C6H8O2·H2O），2%瓊脂，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（W/V）和種子培養(yǎng)基（W/V）：成分與富集培養(yǎng)基相同；所用培養(yǎng)基和所用玻璃儀器在使用之前都要經(jīng)過121 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 將腐爛的水果切碎后放置于小燒杯內(nèi)，向燒杯中加入無菌生理鹽水，使水面淹沒水果，室溫下振蕩30 min，使水果上的細菌充分地溶入到生理鹽水中[6]。

1.3.2 菌種分離 吸取10 mL浸泡過腐爛水果的生理鹽水注入到90 mL富集培養(yǎng)基中，放在恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃條件下靜置富集培養(yǎng)7 d。再吸取10 mL富集培養(yǎng)液于90 mL富集培養(yǎng)基中，如此富集繼代分批培養(yǎng)[7]進行5次后，富集培養(yǎng)液表面依然有膜的再進行梯度稀釋分離純化。梯度稀釋至10-15選取10-9～10-15的濃度各吸取100 μL稀釋菌液，用無菌的玻璃珠涂布于固體分離培養(yǎng)基制成的平板上，放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30 ℃培養(yǎng)1 d。挑取平板上的單菌落接種于種子培養(yǎng)基上，160 r/min 30 ℃振蕩活化培養(yǎng)24 h，以6%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d，觀察培養(yǎng)液表面有白色的膜生成的菌種即有可能是產(chǎn)纖維素菌株。

1.3.3 產(chǎn)物鑒定 取出培養(yǎng)液表面的膜，用去離子水沖洗3～5次，洗去表面雜質(zhì)，放入5%的NaOH溶液中100 ℃處理2 h后，如果培養(yǎng)液表面的膜不分解則證明這種膜是細菌纖維素[2]，對應(yīng)菌株就是可產(chǎn)細菌纖維素的菌株。

1.3.4 產(chǎn)量測定 取出纖維素膜后用去離子水沖洗3～5次，再用0.1 mol/L的NaOH溶液煮沸至纖維素膜呈透明或白色，去除其中的培養(yǎng)基和菌體即可，取出處理過的細菌纖維素膜后用去離子水沖洗纖維素膜至pH 7.0[8]。將纖維素膜鋪平后測量膜的厚度[2]，瀝干膜的表面水分，即為纖維素濕膜，稱量濕膜的重量為纖維素膜的濕重[8，9]。纖維素膜放在80 ℃條件下過夜烘干后稱取干重[10]。細菌纖維素產(chǎn)量分別表示為：纖維素濕（干）重/培養(yǎng)液體積。

1.3.5 生理生化鑒定在固體分離培養(yǎng)基上30 ℃劃線培養(yǎng)M7菌株，18 h后挑取單菌落革蘭氏染色，制備合適濃度的菌懸液，具體處理過程和文獻[11]相同。用VITEK-32全自動微生物鑒定儀和革蘭氏陰性菌鑒定卡對M7菌株進行生化鑒定。

1.3.6 分子鑒定按照氯仿-苯酚混合法提取M7菌株基因組DNA[12]后，在94 ℃ 5 min，（94 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min）循環(huán)35次，72 ℃ 10 min條件下PCR，所用引物為27F（5′-AGAGTTTGATCC

TGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTA

CGACTT-3′）。PCR擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳，用TIANGEN瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)品，測序后將16S rRNA分子序列提交到NCBI進行BLAST比較，初步確定M7菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

從19種腐爛水果中篩選出108株不同種類的細菌，其中從山楂中篩選出的3個菌株：SZ4，SZ5，SZ6和從蘋果中篩選出的PG6以及從番茄中篩選出的FQ2均可產(chǎn)纖維素，從芒果中篩選出的1株天然混合菌可以產(chǎn)細菌纖維素，從這株混合菌中分離出1種產(chǎn)纖維素菌株M7。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后測得6種產(chǎn)細菌纖維素菌株的產(chǎn)膜情況和pH等基本特征見表1。

由表1可知，M7菌株纖維素產(chǎn)量最高，開始產(chǎn)膜所需時間最短，持續(xù)產(chǎn)膜時間最長，經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)產(chǎn)量穩(wěn)定，M7菌株培養(yǎng)14 d后的最終pH為4.0，初始pH為6.0，生長pH明顯下降，適合生長的pH為4.0～6.0。M7菌株在160 r/min，30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)14 d和30 ℃條件下靜置培養(yǎng)相同時間后，測得產(chǎn)量和pH見表2。

由表2可知，M7菌株在靜置條件下培養(yǎng)細菌纖維素產(chǎn)量更高，表明M7菌株更適合在靜置條件下培養(yǎng)產(chǎn)細菌纖維素。

2.2 菌株特征

2.2.1 形態(tài)特征 M7菌株在培養(yǎng)40 h后的菌落直徑為0.4～0.5 mm，白色，表面光滑，菌落周圍整齊。M7菌株菌落在顯微鏡下的形態(tài)如圖1所示，M7菌菌落外觀如圖2所示。

M7菌株經(jīng)革蘭氏染色后的顯微照片如圖3所示，由圖3可知，M7菌株在顯微鏡下為短桿狀，長1.1～1.6 μm，寬0.4～0.5 μm，革蘭氏染色為陰性。

2.2.2 生理生化特征 M7菌株革蘭氏染色為陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，用革蘭氏陰性菌鑒定卡和ITEK-32全自動微生物鑒定儀鑒定[11]該菌株為葡糖醋桿菌屬。

2.2.3 分子鑒定結(jié)果 采用菌株通用引物27F和1492R進行PCR擴增，空白對照組不加模板DNA，其余操作完全一樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖4，回收純化PCR樣品送TaKaRa公司測序，結(jié)果表明M7菌株16S rRNA全長1 453 bp，將16S rRNA分子序列提交到NCBI進行BLAST比較初步確定為葡糖醋桿菌屬，這和通過VITEK-32全自動微生物鑒定儀鑒定結(jié)果相吻合，將M7菌株16S rDNA序列提交到GenBank，序列號為JX303335。

2.3 細菌纖維素形態(tài)特征

圖5、圖6分別為100 mL培養(yǎng)液的M7菌株30 ℃靜置培養(yǎng)14 d所產(chǎn)的細菌纖維素膜在用NaOH溶液處理前后的狀態(tài)。圖7為M7菌株在160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)條件下所產(chǎn)纖維素的形態(tài)圖。由圖5和圖6可知，M7菌株在30 ℃靜置培養(yǎng)14 d所產(chǎn)細菌纖維素膜硬實、有彈性，而M7菌株在30 ℃振蕩培養(yǎng)14 d后產(chǎn)的細菌纖維素為白色顆粒狀（圖7）。

2.4 混合菌產(chǎn)量比較

對起初分離出M7菌株的混合菌的產(chǎn)膜情況進行了分析。經(jīng)過分離純化確定混合菌中只有1種產(chǎn)細菌纖維素菌株M7，混合菌和M7菌株分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)至產(chǎn)膜終止后，測定其產(chǎn)膜狀況（表3）。由表3可知，混合菌的細菌纖維素產(chǎn)量和產(chǎn)膜持續(xù)時間都明顯比M7菌株單獨培養(yǎng)時的高。

3 結(jié)論

1）從自然腐爛的水果中篩選出6株產(chǎn)細菌纖維素菌株，其中從芒果中篩選出的M7菌株纖維素產(chǎn)量最高且產(chǎn)量穩(wěn)定；

2）通過對M7菌株不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)量對比，發(fā)現(xiàn)M7菌更適合在靜置條件下產(chǎn)細菌纖維素，適合生長的pH為4.0～6.0；

3）M7菌株經(jīng)過形態(tài)鑒定、生理生化特征分析和16S rDNA分子序列分析初步確定為葡糖醋桿菌；

4）M7菌株是從1株高產(chǎn)混合菌中分離純化得到的細菌，M7菌株在同其他8種單獨培養(yǎng)不產(chǎn)細菌纖維素的細菌混合培養(yǎng)時濕重產(chǎn)量達617.3 g/L，干重產(chǎn)量為23.9 g/L，說明M7菌株是一種高產(chǎn)細菌纖維素菌株。

4 討論

M7菌株在富集繼代分批培養(yǎng)過程中能否占優(yōu)勢，取決于它與其他菌的比生長速率的競爭，在試驗所采用的培養(yǎng)條件下要保持一定的選擇壓力使目的菌維持最大的比生長速率，就要嚴格控制移種時間和次數(shù)[7]，本研究采用30 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d后，以10%的接種量富集培養(yǎng)獲得了較好的效果。

另外，從混合菌產(chǎn)量和單獨M7菌株培養(yǎng)時的產(chǎn)量比較可知，混合菌的細菌纖維素產(chǎn)量和產(chǎn)膜持續(xù)時間都明顯比M7菌株單獨培養(yǎng)時的高。故推測多種細菌共同生長時M7菌株可能會從其他細菌獲得促進M7菌株產(chǎn)細菌纖維素的物質(zhì)，經(jīng)過多次富集繼代分批培養(yǎng)后逐漸改變了混合菌中各種細菌的數(shù)量比，在每隔7 d富集繼代分批培養(yǎng)傳代一次的條件下，最終M7菌株成為優(yōu)勢菌群，其他各種細菌數(shù)量比適當?shù)臈l件下可以使細菌纖維素產(chǎn)量有效提高，但是在混合菌培養(yǎng)時是何種營養(yǎng)成分促進了細菌纖維素產(chǎn)量的提高以及混合菌的種類和數(shù)量需要進一步的研究。

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