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    液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜法同時測定蟲生真菌菌絲中16種游離氨基酸*

    2013-12-25 05:55:48劉肖肖李淑林陸瑞利羅飛飛胡豐林
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2013年1期
    關(guān)鍵詞:游離標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜

    劉肖肖,李淑林,陸瑞利,羅飛飛,胡豐林

    1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥,230036)

    2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系,安徽合肥,230036)

    蟲生真菌(entomogeneous fungi)是一種以昆蟲為寄主的內(nèi)生真菌,具有有性型和無性型兩種存在形式。蟲草屬中的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)和蛹蟲草(Cordyceps militaris)以及它們的無性型中國被毛孢(Hirsutella sinensis)和蛹擬青霉(Paecilomyces militari)[1-2]已被廣泛地用于保健食品和藥品[3-4]。目前關(guān)于蟲草及其無性型的研究主要集中在甘露醇、核苷、多糖、抗氧化和抗腫瘤等活性成分[5-7],而缺乏對蟲草及其無性型中的游離氨基酸組成的系統(tǒng)研究。游離氨基酸是食品中可以被人體直接吸收的重要營養(yǎng)物質(zhì),同時又是食品中主要的風(fēng)味物質(zhì),因此,測定蟲草及其無性型中各種游離氨基酸的含量,將可作為評價該類真菌的食用和保健價值的重要指標(biāo)。

    由于多數(shù)氨基酸不具有紫外吸收和熒光檢測的發(fā)色基團(tuán),所以當(dāng)用傳統(tǒng)的液相色譜或氨基酸分析儀測定氨基酸含量時,首先要對氨基酸進(jìn)行衍生化處理,分析過程較復(fù)雜[8],同時衍生化處理容易形成非目標(biāo)衍生物,從而影響氨基酸測定的準(zhǔn)確性。相比較而言,近年來應(yīng)用越來越普及的液相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[9-10],具有較高的分辨率和檢測的靈敏度,對樣品的檢測限可以達(dá)到納克級,遠(yuǎn)高于普通的HPLC方法;同時能夠?qū)悠分刑囟ńM分單獨(dú)提取分析,可有效地避免在HPLC上出現(xiàn)的重疊峰的干擾;樣品無需進(jìn)行衍生化處理,實(shí)驗(yàn)過程簡單,準(zhǔn)確性高,然而目前尚無以之對蟲生真菌中游離氨基酸進(jìn)行分析檢測的報道。因此,本文擬采用液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜(LC-ESI-TOF-MS)聯(lián)用分析法,建立一種簡捷,高效及高靈敏度的測定蟲生真菌中游離氨基酸含量的方法,為蟲生真菌中游離氨基酸的檢測、資源利用和食用質(zhì)量評價提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    1.1.1 供試菌株

    中國被毛孢(Hirsutella sinensis)菌株號為RCEF5042;蛹擬青霉(Paecilomyces militari)菌株號為RCEF0720;古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)菌株號為RCEF0199;蟬棒束孢(Isaria cicadae)菌株號為RCEF4777;細(xì)腳棒束孢(Isaria tenuip)菌株號為RCEF4256;戴氏綠僵菌(Metarhizikum taii)菌株號為RCEF4127;粉被瑪利亞霉(Mariannaea puinosa)菌株號為RCEF4695,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蟲生真菌研究中心提供。

    1.1.2 材料與試劑

    色譜純甲醇,色譜純乙腈,色譜純甲酸,均購于美國Tedia公司;16種氨基酸(分析純):脯氨酸(Pro),纈氨酸(Val),亮氨酸(Leu),異亮氨酸(Ile),賴氨酸(Lys),甲硫氨酸(Met),組氨酸(His),苯丙氨酸(Phe),精氨酸(Arg),酪氨酸(Tyr),色氨酸(Try),絲氨酸(Ser),蘇氨酸(Thr),胱氨酸(Cys),天冬氨酸(Asp),谷氨酸(Glu),購于中國藥品生物制品鑒定所。

    1.1.3 主要儀器

    高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀(Agilent 6210 time of flight LC/MS),包括 Agilent1100高效液相色譜(HPLC),二極管陣列檢測器(DAD),飛行時間質(zhì)譜儀(TOF)和電噴霧離子源(ESI),購于美國Agilent公司;供試分析型高效液相色譜柱有Agilent Eclipse XDB-C18(2.1 mm ×150 mm,5μm)、Waters Xterra MS C18(2.1 mm ×150 mm,3.5μm)和 Phenomenex Synergi Hydro-RP(4.6mm ×250mm,4μm),分別購于Agilent、Waters和 Phenomenex公司;AN0635 電子天平,購于上海民橋精密科學(xué)儀器公司;FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng),購于美國Labonconco公司;2K-15超速離心機(jī),購于Sigma公司;KQ5 200DE型數(shù)控超聲波清洗器,購于昆山市超聲儀器有限公司;SimplicityRUV超純水系統(tǒng),購于Millipore公司。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

    精確稱取16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,溶解于30%的甲醇水溶液,分別得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ(含脯氨酸(Pro),纈氨酸(Val),亮氨酸(Leu),異亮氨酸(Ile),賴氨酸(Lys),甲硫氨酸(Met),苯丙氨酸(Phe)和精氨酸(Arg),它們的濃度均為500 μmol/L);混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ(含絲氨酸(Ser),蘇氨酸(Thr),胱氨酸(Cys),組氨酸(His),天冬氨酸(Asp),谷氨酸(Glu),酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Try),它們的濃度均為125 μmol/L)。這些標(biāo)樣在測定前用30%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

    1.2.2 樣品前處理

    精確稱取各蟲生真菌固體培養(yǎng)菌絲體的凍干粉200 mg,溶于4 mL 30%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸),25℃超聲提取30 min,1 2000 r/min離心10 min取上清液,即得50 mg/mL的待測樣品溶液。制備好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液在4℃暫存?zhèn)溆?,保存時間不得超過 24 h[10-11]。

    1.2.3 色譜條件

    進(jìn)樣體積:5 μL;流速:0.60 mL/min;柱溫箱:25℃;供試流動相體系為含0.1%甲酸的甲醇水體系和乙腈水體系,采用梯度洗脫,洗脫梯度為:0~8 min由100%的流動相A(水相)洗脫;8~15 min流動相B(有機(jī)相)比例由0%增加到15%;15~23 min流動相B由15%增加到20%;23~30 min流動相B由20%增加到50%。

    1.2.4 質(zhì)譜條件

    電噴霧(ESI)離子源的霧化氣壓:0.24 MPa(35psi);氮?dú)饬魉?12.0 L/min;毛細(xì)管溫度:325℃;離子掃描范圍(m/z):50~1000;陰離子模式下離子化電壓:3 500 V;碎片電壓:175 V;陽離子模式下離子化電壓:4 000 V;碎片電壓:250 V。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜柱及色譜條件初步選擇

    由于氨基酸是極性較強(qiáng)的化合物,因此初步選擇了3個適合極性化合物分析的高效液相色譜柱進(jìn)行初步比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)以Phenomenex Synergi Hydro-RP色譜柱,以乙腈水為流動相時分離效果最好。具體流動相條件為:A相為0.1%甲酸水溶液;B相為0.1%甲酸乙腈溶液;流動相梯度為:0~8 min用100%A相洗脫;8~15 min B相由0%增加到15%;15~23 min B相由15%增加到20%;23~30 min B相由20%增加到50%。

    2.2 質(zhì)譜條件的確定

    實(shí)驗(yàn)分別測定了16種氨基酸在陽離子模式和陰離子模式下的電離情況,結(jié)果顯示:16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品在陽離子模式下的主要離子碎片為脫羧基、脫氨基和脫水后形成的離子,即[M-HCOOH+H]+、[MH2O+H]+或[M-NH3+H]+;同時,含支鏈氨基酸的支鏈會發(fā)生不同程度的斷裂,芳香類氨基酸還會產(chǎn)生多種苯基離子碎片,離子種類較復(fù)雜,不利于定量分析。而在陰離子模式下,16種氨基酸的離子碎片主要為準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-,離子碎片專一,穩(wěn)定性高,增加了檢測的靈敏度和定量范圍,可見采用陰離子分析模式較好。

    陰離子模式下測定的16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    表1 16種氨基酸在陰離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectra data of 16 amino acids detected under negative ionization mode

    2.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的定性及定量分析

    2.3.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的定性分析

    在陰離子模式下,將16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液單獨(dú)進(jìn)樣得到各種氨基酸準(zhǔn)確的質(zhì)譜圖(見圖1)。根據(jù)質(zhì)譜圖提供的離子碎片,可確定各氨基酸最優(yōu)的定量離子均為準(zhǔn)分子離子峰(見表1)。雖然亮氨酸和異亮氨酸具有相同的分子離子,但亮氨酸和異亮氨酸的出峰時間不同,先出峰為異亮氨酸,據(jù)此可對二者進(jìn)行準(zhǔn)確分析。此外,纈氨酸的準(zhǔn)分子離子(m/z)為116.072與色氨酸的吲哚基離子(m/z:116.050)質(zhì)荷比接近,但二者的色譜保留時間不同,因此可準(zhǔn)確區(qū)分。總之,在陰離子模式下16種氨基酸都可以達(dá)到定量測定的要求。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中提取的16種氨基酸的離子流圖如圖2所示。

    圖1 陰離子模式下16種氨基酸的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of 16 amino acids detected under negative ionization mode

    2.3.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的定量分析

    將2.1中配置的氨基酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按相應(yīng)的質(zhì)譜條件依次進(jìn)樣測定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得16種氨基酸的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(見表2)。根據(jù)樣品中16種氨基酸含量的差異,對各種氨基酸的線性范圍進(jìn)行了優(yōu)化,從而得到最優(yōu) 的回歸方程和最佳測定濃度(見表2)。

    圖2 陰離子模式下氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中16種氨基酸的離子流圖Fig.2 Ion flow of 16 amino acids detected under negative ionization mode

    表2 16種氨基酸的線性回歸方程,相關(guān)系數(shù),RSD及回收率的測定結(jié)果Table 2 Linear regression equation,coefficient of correlation,RSD and recovery ratio of the 16 amino acids

    2.4 精密度測定

    精確配制濃度為50 μmol/L的16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液,按相同的質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,計(jì)算峰面積,求得16種氨基酸的的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.84% ~2.75%之間(見表2)。

    2.5 回收率測定

    準(zhǔn)確配制25 mg/mL的細(xì)腳棒束孢樣品溶液,加入適量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),按與試驗(yàn)樣品相同的方法測定峰面積,求得16種氨基酸的回收率為97.1%-102.8%(見表2)。

    表3 7種蟲生真菌樣品中16種游離氨基酸的含量Table 3 Contents of 16 amino acids of the seven tested entomogenous fungi

    2.6 7種蟲生真菌樣品中16種游離氨基酸含量的分析

    按照前面優(yōu)化的方法,對7種蟲生真菌菌絲樣品中16種游離氨基酸的含量進(jìn)行了測定,結(jié)果見表3。從表中可以看出,同一菌株中各種氨基酸的含量相差較大,但所有菌株中含量最高的均為苯丙氨酸,其中,中國被毛孢的苯丙氨酸含量最高為2.173 mg/g;各菌株中胱氨酸的含量均很低,在最低線性濃度外;各菌株中脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和苯丙氨酸(Phe)含量基本在0.3 mg/g以上,較其他氨基酸含量明顯較高,它們和苯丙氨酸一起可作為蟲生真菌中游離氨基酸的特征指標(biāo)。不同菌株間同種氨基酸含量也存在一定差異,對于含量最高的苯丙氨酸在不同菌株間的含量差異為0.718~2.173 mg/g;絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)在戴氏綠僵菌中的含量明顯高于其他菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,不同菌株間游離氨基酸總含量也存在較大差異,中國被毛孢中游離氨基酸總含量為7.537 mg/g,較蟬擬青霉(3.196 mg/g)的總含量高出1.36倍。

    3 結(jié)論

    本文采用液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜(LCTOF-MS)聯(lián)用技術(shù),在陰離子電離模式下,可快速地對16種氨基酸進(jìn)行定性和定量測定。16種氨基酸的色譜特征和質(zhì)譜離子特征明顯,可準(zhǔn)確定性。定量試驗(yàn)結(jié)果表明,16種氨基酸的線性范圍廣準(zhǔn)確性高,在相關(guān)系數(shù)大于0.998時,線性范圍都能達(dá)到4.0~125 μmol/L,最大可達(dá)2.0 ~500 μmol/L;在氨基酸濃度為50 μmol/L時,16種氨基酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.84% ~2.75%之間;回收試驗(yàn)結(jié)果顯示,回收率為97.1%~102.8%。用液質(zhì)聯(lián)用法對中國被毛孢、蛹擬青霉、古尼擬青霉、蟬棒束孢、細(xì)腳棒束孢、戴氏綠僵菌和粉被瑪利亞霉菌絲樣品中16種游離氨基酸含量的測定結(jié)果顯示,同一菌株中各種氨基酸的含量相差較大,但所有供菌株中含量最高的均為苯丙氨酸,它在不同供試菌株中的含量范圍為0.718~2.173 mg/g,其中中國被毛孢的苯丙氨酸含量最高;供試菌株中含量較高的氨基酸還有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸,它們含量大部分都在0.3 mg/g以上,較其他氨基酸含量明顯較高,可作為判定蟲生真菌中游離氨基酸的特征指標(biāo)。不同菌株間游離氨基酸總量也存在較大差異,中國被毛孢中游離氨基酸總含量為7.537 mg/g,較蟬擬青霉 (3.196 mg/g)的總含量高出1.36倍??傊?,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以準(zhǔn)確地對蟲生真菌中16種游離氨基酸進(jìn)行快速檢測,其測定結(jié)果可為蟲生真菌中游離氨基酸特征鑒定、資源利用和食用價值評價提供技術(shù)和理論參考。

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