骨形態(tài)發(fā)生蛋白—2基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合對(duì)氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物移植促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究

周諾 黃旋平 江獻(xiàn)芳 宋繼傳 李華 謝慶條

[摘要] 目的 探討人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合可注射骨組織工程支架材料對(duì)氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物（Pluronic F-127）移植對(duì)兔下頜骨牽張成骨新骨形成的促進(jìn)作用。方法 將48只新西蘭白兔隨機(jī)分為4組，每組12只。建立下頜骨牽張成骨動(dòng)物模型，固定期第2天A組于牽張間隙注射200 μL BMP-2基因修飾BMSCs與Pluronic F-127復(fù)合物；B組注射等量BMP-2基因修飾BMSCs液；C組注射等量BMSCs液；D組注射等量生理鹽水。分別于固定2、6周時(shí)處死半數(shù)動(dòng)物獲取標(biāo)本，通過(guò)X線片、組織切片及免疫組化觀察骨質(zhì)愈合改建情況。結(jié)果 通過(guò)X線片及免疫組化觀察并經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件分析，在固定2周和6周時(shí)，A組牽張區(qū)內(nèi)骨密度和BMP-2蛋白的表達(dá)明顯高于B、C、D組（P<0.01），B組明顯高于C組和D組（P<0.01）；C組和D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。A、B組間隙內(nèi)成骨質(zhì)量好于C、D組，A組好于B組。結(jié)論 BMP-2基因修飾BMSCs復(fù)合可注射骨組織工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨新骨形成。

[關(guān)鍵詞] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2； 基因； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 對(duì)氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物； 牽張成骨； 新骨形成

[中圖分類號(hào)] R 781 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.008

研究[1-5]表明牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）在顱頜面整形、腫瘤術(shù)后重建、牙槽種植等方

面有廣闊的應(yīng)用前景。但牽張成骨的某些局限性如牽張速度受限、治療周期長(zhǎng)等問(wèn)題限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種有效促進(jìn)牽張成骨新骨形成的方法來(lái)縮短其治療周期成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

對(duì)氧化聚乙烯和聚丙烯共聚物（Pluronic F-127）

（Sigma公司，美國(guó)），SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），X線機(jī)（青島海諾公司），病理圖像分析儀（DMR+Q550，Leica公司，德國(guó)），兔下頜骨牽張器（西安中邦公司定制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康新西蘭白兔48只為研究對(duì)象，兔齡2～3個(gè)月，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。

1.3 干預(yù)分組

將48只新西蘭白兔隨機(jī)分為4組，每組12只。在牽張結(jié)束后固定期第2天，A組于牽張間隙注射200 μL骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，

BMP-2）基因修飾骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）與Pluronic F-127的復(fù)合物；B

組注射等量BMP-2基因修飾BMSCs液；C組為對(duì)照組，注射等量自體BMSCs液；D組為空白對(duì)照，注射等量生理鹽水。

1.4 方法

1.4.1 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（human bone morphoge-

netic protein-2，hBMP-2）基因克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)從人

骨肉瘤中擴(kuò)增出hBMP-2基因片段，通過(guò)DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pcDNA 3.1真核表達(dá)載體上，構(gòu)建成pcDNA3.1-hBMP2重組質(zhì)粒[6]。

1.4.2 兔自體BMSCs的分離培養(yǎng)及hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾 術(shù)前分別根據(jù)編號(hào)對(duì)實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物自脛骨上端穿刺抽取骨髓，并做好對(duì)應(yīng)編號(hào)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將兔自體BMSCs培養(yǎng)傳代至第3代細(xì)胞后行hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾[7]。

1.4.3 Pluronic F-127與hBMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾兔BMSCs的混合 注射前將所收集的用BMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾的2×107個(gè)兔BMSCs離心去上清，然后加含滅活血清的DMEM培養(yǎng)基0.3～0.4 mL制成細(xì)胞懸液，再加入Plu-ronic F-127支架材料0.3～0.4 mL，細(xì)胞懸液與Pluronic F-127的比例為1∶1，充分混勻，制成細(xì)胞濃度為每毫升1×106個(gè)的細(xì)胞混合懸液，振蕩混勻，放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 模型制備 采用3%戊巴比妥鈉（按1 mL·kg-1

給藥）耳緣靜脈注射麻醉，平行下頜下緣做切口，長(zhǎng)

約3～4 cm，切開(kāi)皮膚、皮下組織直達(dá)骨面，在下頜角前1.0 cm處用牙科渦輪機(jī)做垂直骨切開(kāi)（圖1），確認(rèn)骨斷開(kāi)后按預(yù)先所留固位孔安裝牽張器（圖2），分

層縫合傷口。術(shù)后延遲期為5 d，第6天開(kāi)始牽張，每天2次，每次0.5 mm牽張，牽張長(zhǎng)度7 mm，隨后固定。在固定期第2天，于牽張間隙按上述分組進(jìn)行藥物注射治療。

圖 1 切開(kāi)骨皮質(zhì)

Fig 1 Incision of cortical bone

圖 2 安置牽張器

Fig 2 Placement of distractor

1.4.5 獲取標(biāo)本 固定期2、6周時(shí)各組分別處死半數(shù)動(dòng)物，取術(shù)側(cè)下頜骨標(biāo)本，切取牽張區(qū)域及其周圍新骨組織標(biāo)本，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目需要拍攝術(shù)側(cè)下頜骨X線片，然后根據(jù)檢測(cè)方法需要分別對(duì)標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)處理。

1.4.6 X線片檢查及骨密度分析 將固定2、6周各組獲取的標(biāo)本分別攝X線片觀察骨質(zhì)愈合、改建情況。拍攝距離35.0 cm，曝光時(shí)間0.25 s。獲得的膠片經(jīng)掃描轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像后用專用軟件進(jìn)行骨密度分析。在X線片上的牽張區(qū)域水平和垂直方向平均各取3條線，線上各點(diǎn)骨密度平均值數(shù)據(jù)以x±s表示，作為統(tǒng)計(jì)分析的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行骨密度分析。

1.4.7 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 將

經(jīng)10%甲醛固定的標(biāo)本放入15%乙二胺四乙酸（ethy-lenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液（pH值7.2～7.4）中脫鈣，直到用大頭針能順利穿透標(biāo)本為止，后

梯度乙醇脫水，石蠟包埋后制備成4 μm厚度的石蠟切片，600 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，復(fù)水后蘇木素染色，1%鹽酸乙醇酚化，碳酸鋰返藍(lán)，伊紅染色，乙醇脫水，放干燥箱干燥，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4.8 免疫組織化學(xué) 將獲得的脫鈣標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，孵育，沖洗，加一抗BMP-2，同時(shí)做不加一抗的對(duì)照片，以便于結(jié)果判讀；然后加二抗，孵育，DAB顯色后水洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，干燥，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，棕黃色染色為陽(yáng)性染色，免疫組織化學(xué)染色后的切片用病理圖像分析儀進(jìn)行測(cè)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)各時(shí)期各組數(shù)據(jù)行單因素方差分析和多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=

0.05。

2 結(jié)果

2.1 X線片分析

固定2周時(shí)，A組牽張間隙新生骨組織影像密度較高，新生骨組織與原骨組織之間骨融合良好，界限非常模糊（圖3A）。B組、C組及D組牽張間隙新生骨組織影像均呈現(xiàn)低密度影，與周圍原骨組織影像界限都比較明顯。B組牽張間隙內(nèi)新生骨組織密度較C組、D組稍高，下頜骨下緣骨皮質(zhì)厚而連續(xù)，骨切開(kāi)線兩端仍可清晰辨認(rèn)（圖3B）。C組和D組牽張間隙內(nèi)骨密度影更低，兩者牽張間隙內(nèi)骨密度無(wú)明顯差別，牽張間隙內(nèi)新生骨與兩端正常下頜骨影像界限更為明顯，很容易辨認(rèn)（圖3C、D）。

固定6周時(shí)，A組牽張間隙新生骨組織與周圍原骨組織影像密度相似，新生骨組織與原骨組織之間已完全達(dá)到骨融現(xiàn)象，分不清骨界限（圖4A）；B、C、D組牽張間隙內(nèi)新生骨影像均比固定2周時(shí)明顯增高，而B(niǎo)組牽張間隙內(nèi)新生骨影像表現(xiàn)為稍高密度影，新生骨組織和原骨周圍骨組織之間界限較模糊，難以辨認(rèn)（圖4B）；C組和D組牽張間隙新生骨組織影像密度明顯低于A組和B組，邊緣均逐漸變模糊，但仍容易辨認(rèn)，新生骨與周圍骨影像均開(kāi)始出現(xiàn)融合現(xiàn)象（圖4C、D）。

固定2周時(shí)，A、B、C、D組的骨密度值分別為70.67±2.11、46.00±1.13、28.79±1.68、27.94±1.21；固定6周時(shí)，A、B、C、D組骨密度值分別為98.82±2.72、72.78±2.67、58.72±1.26、56.10±2.18。在固定2周和6周時(shí)A組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于B、C、D組（P<

0.01），B組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于C組和D組（P<

0.01），C組和D組牽張區(qū)骨密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 HE染色觀察結(jié)果

固定2周時(shí)，A組牽張間隙內(nèi)已形成良好的骨小梁，骨小梁排列規(guī)則有序，基本沿著牽張方向排列，周圍集聚大量活躍成骨細(xì)胞（圖5A）；B組牽張間隙

內(nèi)亦已形成大量骨小梁結(jié)構(gòu)，骨小梁排列極不規(guī)則，方向各異，骨小梁邊緣聚集大量活躍成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞（圖5B）；C組和D組組織結(jié)構(gòu)相似，牽張間

隙內(nèi)均有大量活躍的成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，并可見(jiàn)少量新生血管和骨小梁結(jié)構(gòu)（圖5C、D）。

固定6周時(shí)，A組牽張間隙內(nèi)已形成成熟的板層骨結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)有清晰的哈弗氏管結(jié)構(gòu)（圖6A）；B組

牽張間隙內(nèi)骨小梁增粗、變大、規(guī)則，基本沿著牽張方向排列，新生骨組織接近正常骨組織水平，可見(jiàn)有少量哈弗氏管結(jié)構(gòu)（圖6B）；C組和D組牽張間隙內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)大量新生骨小梁，骨小梁排列雜亂無(wú)章，方向各異，骨小梁周圍是大量活躍的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞（圖6C、D）。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

固定2周時(shí)，A組新生骨小梁膠原基質(zhì)及其周圍的骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞高度著色，均被染為較深的棕色，提示這些細(xì)胞和組織內(nèi)有BMP-2蛋白的高表達(dá)（圖7A）；B組新生骨小梁膠原基質(zhì)及其周圍的骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞亦著色較深，提示這些細(xì)胞和組織內(nèi)BMP-2蛋白表達(dá)水平亦較高（圖7B）；C組和D組牽張間隙內(nèi)的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及新生血管周圍亦可見(jiàn)被染的棕色，但染色略淺于B組，提示這些細(xì)胞和組織有BMP-2蛋白的表達(dá)，但表達(dá)不如A、B組高（圖7C、D）。

固定6周時(shí)，A組牽張間隙內(nèi)新生骨小梁膠原基質(zhì)、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞被染為較深的棕色（圖8A）；

B組牽張間隙內(nèi)新生骨小梁膠原基質(zhì)、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞較A組稍淺（圖8B）；C組和D組新生骨小梁膠原基質(zhì)及其周圍的骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞亦被輕度染為棕色，但與A組和B組相比，著色較淺（圖8C、D）。

固定2周時(shí)，A、B、C、D組BMP-2蛋白表達(dá)平均灰度值分別為78.86±6.53、114.75±7.71、176.31±8.21、180.16±8.11；固定6周時(shí)，A、B、C、D組BMP-2蛋白表達(dá)平均灰度值分別為126.61±8.73、199.66±9.46、231.63±8.35、238.98±5.85。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：固定2、6周A組平均灰度值均明顯低于B、C、D各組（P<0.01），B組平均灰度值明顯低于C組和D組（P<0.01），

而C組和D組間相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

組織工程是將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體吸附的生物材料上形成復(fù)合物，將此復(fù)合物植入機(jī)體組織、器官的病損部位，細(xì)胞在生物材料逐漸吸收的過(guò)程中，形成新的具有形態(tài)和功能的相應(yīng)組織、器官，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的[8]。牽張成骨技術(shù)因其

本身許多無(wú)可替代的優(yōu)越性使其在顱頜面外科領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但其治療周期過(guò)長(zhǎng)一直是困擾臨床醫(yī)師的難題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和骨創(chuàng)傷愈合機(jī)制研究的進(jìn)展，人們已認(rèn)識(shí)到骨生長(zhǎng)因子在骨代謝和修復(fù)中的重要作用，企圖將外源性生長(zhǎng)因子應(yīng)用于牽張成骨或骨折愈合區(qū)，從而加速骨創(chuàng)傷愈合修復(fù)過(guò)程。但臨床效果卻不盡人意[9-11]。由于外源性應(yīng)用生長(zhǎng)因子促進(jìn)牽張成骨或骨創(chuàng)傷愈合的研究進(jìn)展緩慢，且效果難以肯定，因此，相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者都在積極尋找能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性生長(zhǎng)因子促進(jìn)牽張成骨或骨創(chuàng)傷愈合的方法。

1998年Cao等[12]研究表明：Pluronic F-127是一

種生物相容性和可降解性的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)支架，能運(yùn)載分離的軟骨細(xì)胞，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，作為一種新型可注射性支架材料，它是一種溫敏型材料，在0～4 ℃時(shí)為液態(tài)，超出此范圍則變?yōu)槟z，降解時(shí)間約為6周?？梢?jiàn)，Pluronic F-127不失為一種較理想的組織工程生物材料。在本實(shí)驗(yàn)中用BMP-2作為成骨性誘導(dǎo)因子，利用基因轉(zhuǎn)染方法將其導(dǎo)入兔BMSCs，將其與可注射骨組織工程支架材料Pluronic F-127復(fù)合，并注入到兔下頜牽張成骨區(qū)。通過(guò)X線片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在固定2周和6周時(shí)A組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于B、C、D組（P<0.01），B組牽張區(qū)內(nèi)骨密度明顯高于C組和D組（P<0.01），C組和D組牽張區(qū)骨密度比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。通過(guò)免疫組化顯示：A組平均灰度值明顯低于B、C、D組（P<0.01），B組平均灰度值明顯低于C組和D組（P<0.01），而C組和D組間相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明A組

和B組BMP-2蛋白出現(xiàn)高表達(dá)，而A組明顯高于B組，C組和D組BMP-2蛋白表達(dá)比較差異不大。HE染色結(jié)果亦提示，在固定2周和6周時(shí)，A組骨痂形成質(zhì)量明顯高于B、C、D組，而B(niǎo)組骨痂形成質(zhì)量又高于C、D組，C組和D組比較差異不大。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)：通過(guò)BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs與Pluronic F-127

復(fù)合注射治療后，在基因、細(xì)胞及支架材料等多方面共同作用誘導(dǎo)下BMP-2蛋白出現(xiàn)高表達(dá)。BMP-2基因進(jìn)一步誘導(dǎo)BMSCs自身或牽張成骨區(qū)的多潛能干細(xì)胞以及可能的成纖維細(xì)胞向成骨或成軟骨細(xì)胞分化，使成骨級(jí)聯(lián)再次啟動(dòng)，重續(xù)定向成骨分化，最終達(dá)到促進(jìn)牽張成骨新骨形成與改建的目的。實(shí)驗(yàn)中筆者通過(guò)X線片、HE染色檢查發(fā)現(xiàn)：從成骨質(zhì)量和質(zhì)地上看，A組明顯優(yōu)于其余各組；B組成骨質(zhì)量稍差于A組，可能是由于缺乏支架材料的作用；而C組和D組在成骨上無(wú)明顯差異，可能由于沒(méi)有支架材料及細(xì)胞因子的作用，BMSCs很快被降解和稀釋的緣故，因而未能達(dá)到促進(jìn)成骨的作用。

Urist等[13]將骨誘導(dǎo)定義為：在一種可擴(kuò)散的骨

形態(tài)發(fā)生蛋白的作用下，間充質(zhì)細(xì)胞向著形成軟骨和骨的方向發(fā)展。根據(jù)Urist的觀點(diǎn)，發(fā)生骨誘導(dǎo)必須具備3個(gè)條件：l）存在可分化為成骨細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞即靶細(xì)胞；2）存在引導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的生物化學(xué)信號(hào)；3）適當(dāng)?shù)某晒黔h(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中將基因細(xì)胞材料注入到兔子牽張間隙后，Pluronic F-127支架材料孔隙內(nèi)有可能充滿了纖維結(jié)締組織和毛細(xì)血管，毛細(xì)血管末稍存在的正在分化的間充質(zhì)細(xì)胞即是向成骨細(xì)胞分化的靶細(xì)胞?？梢哉T導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的生物化學(xué)信號(hào)來(lái)自支架材料對(duì)于體內(nèi)骨生長(zhǎng)生化信號(hào)分子的富集。具有骨誘導(dǎo)作用的Pluronic F-127植入體內(nèi)后，其材料的多孔結(jié)構(gòu)在孔隙內(nèi)造成了一個(gè)有利于新骨形成的高鈣、磷離子濃度的環(huán)境，特別有利于蛋白、骨組織細(xì)胞等的附著，以及骨組織細(xì)胞的分化和增殖，從而提供了一個(gè)優(yōu)良的成骨環(huán)境，最終促進(jìn)了牽張成骨新骨形成和改建的過(guò)程。

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（本文編輯 杜冰）