頂空－固相微萃?。瘹庀嗌V－質(zhì)譜法分析肉豆蔻中揮發(fā)性成分

江欣禪，鈕彪，盧金清 （湖北中醫(yī)藥大學(xué)／湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢430065）

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.除去假種皮的成熟干燥種仁，具有溫中行氣，澀腸止瀉的功效，用于脾胃虛寒，久瀉不止，脘腹脹痛，食少嘔吐［1］。揮發(fā)油是肉豆蔻的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，肉豆蔻揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化以及神經(jīng)中樞作用等多方面的生理活性［2－5］。過(guò)去一般采用水蒸氣蒸餾法（SD）提取肉豆蔻中的揮發(fā)性成分，但該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，樣品需求量大，部分揮發(fā)性成分可能在加熱過(guò)程中丟失，導(dǎo)致無(wú)法分析鑒定。而頂空－固相微萃取法所需樣品量小，不需要有機(jī)溶劑萃取，能簡(jiǎn)便和快速地萃取樣品的揮發(fā)性成分。本研究采用頂空－固相微萃取法（HS－SPME）提取肉豆蔻中的揮發(fā)性成分，并用氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）進(jìn)行成分分析，為肉豆蔻的分析鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 氣相色譜－質(zhì)譜－計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀（HP 6890／5973型，美國(guó)Hewlett－Packard公司）；手動(dòng)固相微萃取裝置（德國(guó)IKA 公司）；100μm PDMS萃取纖維頭（美國(guó)Supelco公司）；頂空瓶（15 mL）（德國(guó)IKA 公司）。

1.2 試藥 肉豆蔻藥材由馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)提供，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室陳科力教授鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁。

2 方法與結(jié)果

2.1 肉豆蔻揮發(fā)性成分的提取 稱取肉豆蔻藥材（經(jīng)粉碎）0.5 g置于15 mL專用頂空瓶中，插入手動(dòng)進(jìn)樣器，75 ℃下預(yù)平衡15 min，頂空萃取15 min，取出，立即插入色譜儀進(jìn)樣口（溫度250 ℃）中，解吸3 min。

2.2 色譜／質(zhì)譜分析條件

2.2.1 色譜條件 HP－5MS石英彈性毛細(xì)管柱（50 m×0.2 mm，0.33μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：氦氣；載氣流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；采用程序升溫：初始溫度為40 ℃，以6 ℃·min－1升溫速率升至220 ℃，保持2 min。2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；倍增管電壓：1.2 kV；接口溫度：280 ℃；質(zhì)量范圍：35～550 m·z－1。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共分離出55個(gè)色譜峰，經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及用面積歸一化法從其總離子流圖中計(jì)算各組分的百分含量，所測(cè)的質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索（質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NIST），并按各峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)核對(duì)，確定了其中的45個(gè)組分，結(jié)果圖1、表1。

圖1 肉豆蔻揮發(fā)性成分的GC－MS總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of the volatile components from nutmeg

表1 肉豆蔻揮發(fā)性成分分析結(jié)果Tab 1 Results of analysis on the volatile components from nutmeg

3 討論

3.1 纖維頭的選擇 在萃取溫度75 ℃，樣品平衡15 min，萃取時(shí)間為15 min條件下，考察2種萃取頭（100μmPDMS萃取頭、65μmPDMS／DVB 萃取頭）的萃取能力。根據(jù)所得峰數(shù)目和峰面積總和，比較2種萃取頭，結(jié)果100μmPDMS萃取頭萃取所得峰數(shù)目和峰面積最多。因此，本實(shí)驗(yàn)選用100μmPDMS萃取頭。

3.2 萃取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)對(duì)達(dá)到吸附平衡所需時(shí)間作了考察，在萃取15，25，35 min的分析結(jié)果中，15～25 min達(dá)到了吸附平衡，總峰面積基本不變。實(shí)驗(yàn)選取萃取時(shí)間為15 min。

3.3 萃取溫度的選擇 萃取溫度升高能增加揮發(fā)性物質(zhì)的個(gè)數(shù)，有利于萃取分析。但當(dāng)達(dá)到一定溫度后，化合物的萃取量減少。本實(shí)驗(yàn)考察了70，75，80 ℃3個(gè)溫度，在其他參數(shù)一定情況下分別進(jìn)行分析，在溫度為75 ℃下所得揮發(fā)性物質(zhì)個(gè)數(shù)較為理想。故選擇75 ℃作為萃取溫度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉豆蔻揮發(fā)性成分中，頂空－固相微萃取法鑒定出45個(gè)化合物，占揮發(fā)性成分的97.42%。主要為單萜類及其含氧衍生物和芳香族類化合物。其中皮蠅磷含量最高，為39.23%，其余含量較高的成分為（1R）－（＋）－α－蒎?。?3.38%）和雙戊烯（9.63%）。皮蠅磷常作畜用殺蟲(chóng)劑，供牲畜吞服、噴涂體表、洗浴等。實(shí)驗(yàn)研究表明α－蒎稀對(duì)白色念珠菌的生物合成有顯著的抑制作用，其抗菌機(jī)制是通過(guò)抑制白色念珠菌細(xì)胞膜中麥角固醇、胞壁中幾丁質(zhì)、多糖的合成及抑制核酸DNA、RNA 的合成，從而起到殺菌作用［6］。

前期實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻揮發(fā)油（2次實(shí)驗(yàn)藥材批次相同），確定了38 個(gè)組分，主要為皮蠅磷（27.55%）、β－蒎?。?0.05%）和（－）－4－萜品醇（7.96%）［7］。與采用水蒸氣蒸餾法相比，頂空－固相微萃取法萃取發(fā)現(xiàn)了月桂烯、α－松油醇、醋酸松油酯、α－石竹烯等。由于在水蒸氣蒸餾法中肉豆蔻與水長(zhǎng)時(shí)間加熱，一些熱敏物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)，造成2種方法所得提取物的數(shù)量、組成及各成分的相對(duì)百分含量存在一定差異。但2種方法所得的揮發(fā)性物質(zhì)中共有20 個(gè)相同的化合物，分別占揮發(fā)性成分的66.38%（SPME）和69.07%（SD）。主要揮發(fā)性成分差別不明顯，表明HS－SPME／GC－MS聯(lián)用能全面快速獲得其組成信息，可應(yīng)用于肉豆蔻揮發(fā)性成分的分析。

［1］ 中國(guó)藥典.一部［S］.2010：126－127.

［2］ 王遠(yuǎn)志，李宏志.兩種肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)人癌細(xì)胞體外增殖影響的比較研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（6）：847－848.

［3］ 賈天柱.再論中藥生熟的變化與作用［J］.中成藥，2006，28（7）：

984－986.

［4］ 李榮，孫健平，姜子濤.肉豆蔻精油抗氧化性能及清除自由基能力的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30（11）：75－80.

［5］ 姜美子，李莉，毛翹，等.肉豆蔻提取物對(duì)鼠性小膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（9）：1259－1261.

［6］ 夏忠弟，余俊龍.α－蒎稀對(duì)白色念珠菌生物合成的影響［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2000，10（1）：44－47.

［7］ 盧金清，李雨玲，李婷，等.肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分GC－MS分析［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（3）：202－204.