HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地魚(yú)腥草中不同部位蘆丁的含量

李瑞玲 ，崔運(yùn)啟，劉奇森

黃淮學(xué)院化學(xué)化工系，駐馬店463000

魚(yú)腥草為三白草棵蕺菜屬植物的全草，具有清熱解毒、利尿消腫、止血等功效［1］，傳統(tǒng)中醫(yī)上主要應(yīng)用于腫痛吐膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、癰腫瘡毒等癥的治療［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明:魚(yú)腥草有抗病、抗菌、解熱、抗炎鎮(zhèn)痛、升白細(xì)胞等作用［3］。魚(yú)腥草含有多種有效成分，如槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、阿福豆苷、瑞諾苷、金絲桃苷、蘆丁等黃酮類化合物［4］。蘆丁及其衍生物具有廣泛的藥理活性，臨床上主要用于防治腦出血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜和急性出血性腎炎［5］。雖然有文獻(xiàn)對(duì)魚(yú)腥草中槲皮素［1］、綠原酸［6］等含量進(jìn)行報(bào)道，但對(duì)魚(yú)腥草中蘆丁的含量分析，報(bào)道的比較少，據(jù)我們的現(xiàn)有文獻(xiàn)，僅見(jiàn)一篇文獻(xiàn)報(bào)道了魚(yú)腥草中蘆丁的含量［7］。對(duì)全國(guó)不同區(qū)域的魚(yú)腥草中蘆丁含量的分析比較未見(jiàn)報(bào)道。

本文主要對(duì)不同產(chǎn)地魚(yú)腥草的不同部位中蘆丁的含量進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)蘆丁色譜條件的選擇及優(yōu)化，建立測(cè)定魚(yú)腥草中蘆丁含量測(cè)定的方法，并通過(guò)此方法，對(duì)全國(guó)不同產(chǎn)地魚(yú)腥草不同部位的蘆丁含量進(jìn)行分析，探討魚(yú)腥草不同產(chǎn)地和不同部位蘆丁的含量變化關(guān)系，以期為更好地利用和開(kāi)發(fā)魚(yú)腥草提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1200 高效液相色譜儀;CARY100 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);KQ3200B 超聲波清洗儀(余姚市亞星儀器有限公司);DJ-120A 電子天平(福州閔衡電子儀器有限公司)。

魚(yú)腥草藥材購(gòu)于駐馬店同仁堂藥店，經(jīng)河南省天方藥業(yè)有限公司王世兵博士鑒定。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于源葉生物科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào):20120226)。磷酸與甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動(dòng)相(A:0.1%磷酸水溶液，B:甲醇);柱溫:20 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):358 nm。為了獲取較好的分離效果，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［8，11，12］我們?cè)O(shè)計(jì)如下三種梯度洗脫方案見(jiàn)表1。分別對(duì)提取液進(jìn)行分離測(cè)定，比較其效果:

表1 梯度洗脫條件Table 1 Different gradient elution programmes

根據(jù)三種不同洗脫條件的方案分離魚(yú)腥草提取液所得到的HPLC 圖可知，在第I 種方案和第II 種方案的洗脫條件下所得的HPLC 圖譜分離度不高，尤其是第二種方案。而在第III 種方案的洗脫條件下所得的圖譜分離度高，蘆丁與前后兩個(gè)峰的分離度分別為R1=2.63，R2=2.15，適合于表征魚(yú)腥草中蘆丁的含量。所以本實(shí)驗(yàn)采用第III 種方案的洗脫條件。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

將20 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用體積濃度為70%的甲醇溶液定容至10 mL，然后分別配成7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取一定量的魚(yú)腥草莖(或葉)粉碎，過(guò)40 目篩，然后按1∶10 的料液比將5.000 g 魚(yú)腥草粉末加入50 mL 60%的甲醇溶液，于60 ℃超聲提取45 min，離心、過(guò)濾，得到生藥供試品溶液。所有供試品溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，供HPLC 測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系

用甲醇溶液依次精確配制濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入液相色譜儀，記錄蘆丁色譜峰的峰面積。以峰面積y 對(duì)濃度(mg/mL)進(jìn)行回歸分析。得回歸方程為:

Y=28596X+18.102，R=0.9999

蘆丁在0. 02～0. 50 mg/mL 之間線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度

取魚(yú)腥草同一供試品溶液，按上述HPLC 條件，一日內(nèi)連續(xù)測(cè)定3 次，計(jì)算峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.94%。連續(xù)三日同一時(shí)間對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.75%。結(jié)果表明方法的精密度良好。

2.4.3 重現(xiàn)性

等量稱取一定質(zhì)量的魚(yú)腥草粉末，平行做三組實(shí)驗(yàn)，計(jì)算峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.57%。結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.4.4 回收率

取5.000 g 魚(yú)腥草粉末加入2.0 mg 標(biāo)準(zhǔn)品，按2.3 節(jié)方法制備待測(cè)液，測(cè)定回收率，蘆丁的加標(biāo)回收率為92.0%(n=3)。

2.5 樣品測(cè)定

按照“2.3”項(xiàng)下的方法對(duì)不同產(chǎn)地及不同部位的魚(yú)腥草粉末進(jìn)行處理，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算蘆丁的含量。結(jié)果如下:

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination of samples

3 討論

魚(yú)腥草中所含化合物種類繁多，分離難度大，流動(dòng)相的選擇是關(guān)鍵。本文通過(guò)不同方案的分離結(jié)果對(duì)比與理論計(jì)算得到一種分離度較好的梯度洗脫色譜條件。從實(shí)驗(yàn)也可以看出色譜峰分離良好。

本論文首次在全國(guó)領(lǐng)域內(nèi)，即中國(guó)的北部、中部和南部，對(duì)不同產(chǎn)地的魚(yú)腥草中蘆丁的含量進(jìn)行測(cè)定對(duì)比，為魚(yú)腥草的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

從測(cè)定結(jié)果看，3 個(gè)不同產(chǎn)地魚(yú)腥草中蘆丁的含量差異較大，其中，產(chǎn)自貴州的蘆丁含量最高，而產(chǎn)自河南南陽(yáng)的含量最低。在部位的比較中，魚(yú)腥草葉中蘆丁的含量普遍高于莖中的含量，大概是5到10 倍。該測(cè)定結(jié)果為魚(yú)腥草的高效利用提供理論依據(jù)。

該實(shí)驗(yàn)方法操作快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可使用于中草藥中蘆丁含量的測(cè)定。

1 Yang ZN(楊占南)，Luo SQ(羅世瓊)，Peng QC(彭全材)，et al.Determination of chlorogenic acid in different fractions of Houttuy cordata Thunb. collected in various areas in Guizhou by high performance liquid chromatography. Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2010，21:1075-1077.

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