銀杏葉內(nèi)生真菌Aspergillus sp.YXf3 活性次生代謝產(chǎn)物的研究

郭志凱 ，劉壽柏，馬 帥

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海口571101;2 海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海口570228

銀杏(Ginkgo biolaba)又名白果、公孫樹，為裸子植物亞門銀杏綱、銀杏科單種屬植物，是我國一種特有的珍貴樹種，是一種經(jīng)濟價值較高的重要藥用植物，其葉和根皮中存在的銀杏內(nèi)酯能阻斷血小板激活因子的活性，改善血液循環(huán)，活化細胞代謝，進而具有保護心腦缺血缺氧不受損害，防治冠心病、腦血栓等多種作用［1］。植物普遍與內(nèi)生菌存在著密切的互利共生關(guān)系，植物內(nèi)生菌生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，被感染的宿主植物(至少是暫時)不表現(xiàn)出外在病癥，即植物內(nèi)生菌可理解為植物組織內(nèi)的正常菌群［2］。植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生多種骨架類型的新穎活性天然產(chǎn)物，是微生物天然產(chǎn)物研究的一個熱點［3］。前人已從銀杏植物組織中分離鑒定出內(nèi)生真菌［4］，并對其次生代謝產(chǎn)物進行了初步研究［5，6］。內(nèi)生真菌菌株Aspergillus sp. YXf3 是從銀杏葉片中分離獲得的，前期已從其發(fā)酵液中分離鑒定出結(jié)構(gòu)新穎的三聯(lián)苯類化合物和二萜類化合物［7］。進一步對其發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的化學(xué)成分研究，從中分離鑒定得到5 個化合物，分別為terreinol (1)、cyclo-(L-Leu-L-Trp)(2)、sphaeropsidin A(3)、sphaeropsidin B(4)和4-hydroxy-3-(3'- methyl-2'-butenyl)benzoic acid(5)。體外神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性的初步評價結(jié)果表明，化合物cyclo-(L-Leu-L-Trp)(2)和sphaeropsidin B(4)具有較強的抑制活性，其IC50分別為4.67 和3.40 μM，具有潛在的利用前景。

圖1 化合物1～5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)由Agilent 6210 TOF LC-MS 質(zhì)譜儀測定(Agilent，美國);單體化合物的1H 和13C NMR 數(shù)據(jù)由Bruker DRX 500 和/或Bruker DRX 300 核磁共振儀(Bruker，德國)測定，并以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，化學(xué)位移以δ (ppm)表示;層析柱硅膠(200～300 目)和薄層層析硅膠(GF254)均為青島海洋化工廠出品;Sephadex LH-20由瑞典Pharmacia Biotech 生產(chǎn);ODS 硅膠來自日本京都Nacalai Tesque 公司;HPLC 系統(tǒng):Waters ODS-5 μm (250 × 4.6 mm，5 μm)，Hitachi pump L-7100 和UV detector L-7400。神經(jīng)氨酸酶抑制測試試劑盒購自Beyotime Instistute of Biotechnology(中國，海門)，利用SUNRISE 酶標儀(Tecan，奧地利)記錄。HPLC 實驗均利用色譜純試劑，其它使用的試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽固體培養(yǎng)基(MEA):麥芽20.0 g、蔗糖20.0 g、蛋白胨1.0 g、瓊脂條20.0 g、重蒸水定容至1000 mL，pH 值自然。麥芽沸水煮30 min 后，過濾、定容分裝。種子平板為MEA 培養(yǎng)基平板;發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽液體培養(yǎng)基，pH 值自然。

1.1.3 菌株

內(nèi)生真菌菌株Aspergillus sp. YXf3 是從江蘇南京大學(xué)鼓樓校區(qū)校園采集的健康銀杏葉片上通過組織分離法分離獲得的［7］。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株發(fā)酵

Aspergillus sp. YXf3 經(jīng)MEA 固體平板活化，培養(yǎng)條件為28 ℃，暗培養(yǎng)5 d。之后將平板中的菌落塊直接接種到裝有300 mL MEA 液體培養(yǎng)基的1000 mL 三角瓶中，三層搖床上發(fā)酵13 d(搖速為140 rpm，26 ℃)后，過濾得菌液。

1.2.2 提取與分離

發(fā)酵結(jié)束后，用三層紗布過濾除去菌體得發(fā)酵液約15 L，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取4 遍，減壓濃縮得乙酸乙酯粗膏3.5 g。該浸膏經(jīng)減壓硅膠柱層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫，在TLC 檢測下合并相似流份得8 個流份(Fr.1～ Fr.8)。Fr.2(0.68 g)(氯仿-甲醇，100∶1)經(jīng)常壓C18ODS 反相柱層析(洗脫液為梯度甲醇水)后，將70%的甲醇水部位(10.6 mg)經(jīng)多次Sephadex LH-20 凝膠柱層析(甲醇為洗脫液)得化合物3(2.0 mg)。其60%的甲醇水部位(205.2 mg)經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析(甲醇為洗脫液)得Fr.2-3-3(120.4 mg)，再經(jīng)HPLC 純化得到化合物4(21.0 mg;甲醇∶水，64∶36;保留時間為30.0 min)。Fr.3(0.20 g)(氯仿-甲醇，100∶2)經(jīng)常壓C18ODS 反相柱層析(洗脫液為梯度甲醇水)，其75%的甲醇水部位(17.3 mg)經(jīng)多次Sephadex LH-20 凝膠柱層析(甲醇為洗脫液)得化合物1(5.0 mg)。Fr.4(0.78 g)(氯仿-甲醇，100∶4)經(jīng)常壓C18 ODS 反相柱層析(洗脫液為梯度甲醇水)，將得到的60%甲醇水部位(32.1 mg)經(jīng)HPLC 分離和Sephadex LH-20凝膠柱層析純化得到化合物5(8.5 mg;甲醇∶水，60∶40;保留時間為19.8 min)。其70%的甲醇水部位(28.2 mg)經(jīng)HPLC 純化得到化合物2 (6.4 mg;甲醇∶水，52∶48;保留時間為26.1 min)。

1.2.3 神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性的測定

按照試劑盒提供的標準方法進行(供試的神經(jīng)氨酸酶與禽流感病毒來源的神經(jīng)氨酸酶高度保守):1.標準曲線檢測的準備:(a)在96 孔熒光酶標板內(nèi)每孔加入70 μL 神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液;(b)每孔再分別加入0、1、2、5、7.5 和10 μL 神經(jīng)氨酸酶;(c)每孔再加入0～20 μL Milli-Q 水使每孔總體積為90 μL。2.樣品檢測的準備:(a)在96 孔熒光酶標板內(nèi)每孔加入70 μL 神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液;(b)每孔再加入10 μL 神經(jīng)氨酸酶;(c)每孔再加入0～10 μL 待篩選的神經(jīng)氨酸酶抑制劑樣品;(d)每孔再加入0～10 μL Milli-Q 水使每孔總體積為90 μL。3.檢測:(a)振動混勻約1 min;(b)37 ℃孵育2 min 使抑制劑和神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，做標準曲線的樣品也一起孵育;(c)每孔加入10 μL 神經(jīng)氨酸酶熒光底物;(d)再振動混勻約1 min;(e)37℃孵育20 min 后進行熒光測定，激發(fā)波長為360 nm、發(fā)射波長為440 nm。4.計算:根據(jù)標準曲線可以計算出樣品對于神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比。以上每個處理做3 個重復(fù)，并對檢測出來的有效抑制劑，做適當(dāng)?shù)臐舛惹€后得出該抑制劑的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 灰白色粉末(甲醇);HR-ESI-MS m/z 273.0898 (calcd for C13H14O5Na，273.0733);1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ:4.83 (1H，d，J =15.7 Hz，H-1a)，4.70 (1H，d，J = 15.7 Hz，H-1b)，6.93 (1H，s，H-6)，2.54 (1H，dt，J = 8.9，12.7 Hz，H-10a)，1.84 (1H，ddd，J = 4.4，8.3，12.7 Hz，H-10b)，2.06 (1H，m，H-11a)，1.98 (1H，m，H-11b)，3.99 (1H，dd，J = 7.6，14.3 Hz，H-12a)，3.92(1H，dd，J = 7.6，14.3 Hz，H-12b)，2.07 (3H，s，H-13)，8.83 (1H，s，HO-3)，9.64 (1H，s，HO-5);13C NMR (DMSO-d6，75 MHz)δ:58.1 (t，C-1)，120.9(s，C-2)，150.9 (s，C-3)，119.2 (s，C-4)，155.2 (s，C-5)，103.1 (d，C-6)，126.0 (s，C-7)，188.3 (s，C-8)，104.6 (s，C-9)，32.2 (t，C-10)，24.3 (t，C-11)，69.4 (t，C-12)，9.5 (q，C-13)。分析以上波譜數(shù)據(jù)，其與文獻［8-10］報道一致，故將化合物1 鑒定為terreinol。

化合物2 白色粉末(丙酮);HR-ESI-MS m/z 322.1526 (calcd for C17H21N3O2Na，322.1526);1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:10.89 (1H，br s，NH-1)，7.08 (1H，s，H-2)，7.57 (1H，d，J = 7.7 Hz，H-4)，6.94 (1H，t，J = 7.7 Hz，H-5)，7.04 (1H，t，J= 7.7 Hz，H-6)，7.31 (1H，d，J = 7.7 Hz，H-7)，3.25 (1H，dd，J = 9.5，14.7 Hz，H-8a)，3.03 (1H，dd，J = 4.3，14.7 Hz，H-8b)，4.09 (1H，m，H-9)，7.87 (1H，br s，NH-10)，2.91 (1H，br dt，J = 1.3，6.5 Hz，H-12)，7.95 (1H，br s，NH-13)，1.41 (1H，m，H-15a)，1.31 (1H，m，H-15b)，1.66 (1H，m，H-16)，0.65 (3H，d，J = 6.5 Hz，H-17)，0.73 (3H，d，J = 6.5 Hz，H-18);13C NMR (acetone-d6，125 MHz)δ:125.6 (d，C-2)，109.8 (s，C-3)，128.6 (s，C-3a)，119.7 (d，C-4)，119.8 (d，C-5)，122.3 (d，C-6)，112.1 (d，C-7)，137.5 (s，C-7a)，30.2 (t，C-8)，56.4 (d，C-9)，169.7 (s，C-11)，53.3 (d，C-12)，169.6 (s，C-14)，42.3 (t，C-15)，24.7 (d，C-16)，21.9 (q，C-17)，23.2 (q，C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［11］報道基本一致，故將化合物2 鑒定為環(huán)二肽化合物cyclo-(L-Leu-L-Trp)。

化合物3 無色針狀晶體(氯仿);HR-ESI-MS m/z 369.1678 (calcd for C20H26O5Na，369.1672);1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:2.22 (1H，br d，J =10.7 Hz，H-1a)，1.58 (1H，m，H-1b)，1.58 (2H，m，H-2)，1.86 (1H，m，H-3a)，1.82 (1H，m，H-3b)，2.72 (1H，s，H-5)，1.35 (1H，br d，J = 14.0 Hz，H-11a)，1.18 (1H，m，H-11b)，1.84 (1H，m，H-12a)，1.64 (1H，m，H-12b)，6.84 (1H，s，H-14)，5.83(1H，dd，J = 10.5，17.5 Hz，H-15)，5.08 (2H，dd，J= 10.5，17.5 Hz，H-16)，1.06 (3H，s，H-17)，1.17(3H，s，H-18)，1.16 (3H，s，H-19)，5.24 (1H，br s，HO-6)。以上氫譜數(shù)據(jù)與文獻［12］報道一致，故將化合物3 鑒定為海松烷型二萜化合物sphaeropsidin A。

化合物4 無色針狀晶體(氯仿);HR-ESI-MS m/z 371.1858 (calcd for C20H28O5Na，371.1829);1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:2.13 (1H，br d，J =12.3 Hz，H-1a)，1.48 (1H，m，H-1b)，1.55 (2H，m，H-2)，1.97 (1H，m，H-3a)，1.48 (1H，m，H-3b)，2.57 (1H，s，H-5)，4.22 (1H，s，H-7)，1.30 (1H，br d，J = 13.3 Hz，H-11a)，1.16 (1H，m，H-11b)，1.69(1H，m，H-12a)，1.59 (1H，m，H-12b)，5.88 (1H，br s，H-14)，5.82 (1H，dd，J = 10.0，17.0 Hz，H-15)，5.02 (1H，d，J = 17.0 Hz，H-16a)，4.99 (1H，d，J= 10.0 Hz，H-16b)，1.00 (3H，s，H-17)，1.22 (3H，s，H-18)，1.11 (3H，s，H-19);13C NMR (acetone-d6，125 MHz)δ:23.1 (t，C-1)，19.2 (t，C-2)，28.2 (t，C-3)，32.5 (s，C-4)，52.3 (d，C-5)，111.2 (s，C-6)，74.9 (d，C-7)，136.8 (s，C-8)，71.7 (s，C-9)，58.7(s，C-10)，41.4 (t，C-11)，31.0 (t，C-12)，38.6 (s，C-13)，133.6 (d，C-14)，148.8 (d，C-15)，111.2 (t，C-16)，24.3 (q，C-17)，33.2 (q，C-18)，22.6 (q，C-19)，176.2 (s，C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［12］報道一致，故將化合物4 鑒定為海松烷型二萜化合物sphaeropsidin B。

化合物5 白色粉末(氯仿);HR-ESI-MS m/z 229.0835 (calcd for C12H14O3Na，229.0844);1H NMR (CDCl3，300 MHz)δ:7.89 (1H，s，H-2)，6.85(1H，d，J = 8.0 Hz，H-5)，7.90 (1H，d，J = 8.0 Hz，H-6)，3.40 (2H，d，J = 6.8 Hz，H-1')，5.32(1H，br t，J = 6.8 Hz，H-2')，1.80 (6H，s，H-4'，-5');部分13C NMR 數(shù)據(jù)(acetone-d6，75 MHz)δ:122.8 (s，C-1)，132.3 (d，C-2)，128.7 (s，C-3)，160.2 (s，C-4)，115.2 (d，C-5)，130.1 (d，C-6)，28.8 (t，C-1')，123.2 (d，C-2')，133.0 (s，C-3')，17.9 (q，C-4')，25.9 (q，C-5')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［13］報道基本一致，故將化合物5 鑒定為4-hydroxy-3-(3'-methyl-2'-butenyl)benzoic acid。

2.2 神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性的初步評價

利用神經(jīng)氨酸酶抑制活性測試試劑盒，對化合物1～5 進行了體外抑制活性測定，以瑞士羅氏制藥公司生產(chǎn)的Oseltamivir(Tamifu，達菲為其商品名)為陽性對照。測試結(jié)果顯示，環(huán)二肽類化合物2 和二萜化合物4 具有較強的體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性，IC50分別為4.67 和3.40 μM，而化合物1、3 和5抑制活性弱，IC50大于30 μM。陽性對照藥Oseltamivir 體外神經(jīng)氨酸酶抑制IC50為0.14 μM。

2.3 討論

本文對銀杏葉內(nèi)生真菌Aspergillus sp. YXf3 次生代謝產(chǎn)物進行了研究，并首次從銀杏內(nèi)生真菌產(chǎn)物中分離鑒定了5 個化合物terreinol(1)、cyclo-(LLeu-L-Trp)(2)、sphaeropsidin A(3)、sphaeropsidin B(4)和4-hydroxy-3-(3'-methyl-2'-butenyl)benzoic acid(5)。其中化合物1 首次報道發(fā)現(xiàn)于土壤真菌Aspergillus terreus［8］，但尚未見其活性報道。植物病原真菌Sphaeropsis sapinea f sp. cupressi 產(chǎn)生植物毒素sphaeropsidin A(3)和sphaeropsidin B(4)，并具有抗真菌活性［12］，但其首次由Ellestad GA 等［14］從真菌Aspergillus chevalieri 中分離得到［分別為LLS491β (3)和γ(4)］，并且發(fā)現(xiàn)化合物3 對一些革蘭氏陽性菌具有顯著的抗菌活性，化合物4 具有抗皰疹病毒活性，且二者都具有強抗梨形四膜蟲的活性。化合物5 首次從山茱萸炭疽病病原真菌Discula sp.分離得到，也具有植物毒活性［13］。本文對化合物1～5 首次開展了神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物2 和4 具有較強的體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性。而目前治療H5N1 型禽流感病毒的藥物都是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如達菲、Zanamivir 等。但達菲價格昂貴，且已發(fā)現(xiàn)了達菲耐受型禽流感病毒，而Zanamivir 不能口服，其應(yīng)用受到限制，因此迫切需要尋找治療禽流感的新型候選藥物。本文從銀杏內(nèi)生真菌中分離出的化合物2 和4 具有較強的體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性，但供試的神經(jīng)氨酸酶不是來源于禽流感病毒，還需對其做進一步的活性評價。

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