殼聚糖/液晶復(fù)合水凝膠的制備及細(xì)胞相容性研究*

司徒方民， 韓婉清， 屠 美△， 査振剛， 曾 戎， 葉菁蕓， 吳 昊， 張嘉晴， 周長忍

(暨南大學(xué)1華文學(xué)院，2 理工學(xué)院材料科學(xué)與工程系，3 教育部人工器官及材料工程研究中心，4附屬第一醫(yī)院，5醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510632)

隨著生物材料及組織工程領(lǐng)域取得的進(jìn)展，已發(fā)展出多種構(gòu)建仿生材料的表面工程技術(shù)［1-2］。表面工程化的生物材料已被證明對蛋白吸附、細(xì)胞相互作用及宿主反應(yīng)有重要作用［3-4］。其中仿生化表面是生物材料制備的重要策略，如表面引入生物活性分子(細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)、生長因子等)［2］，或構(gòu)建軟物質(zhì)細(xì)胞模型均是促進(jìn)細(xì)胞附著、增殖、分化及細(xì)胞相互作用的有效手段［1］。由于合成材料缺少細(xì)胞識別位點(diǎn)，因此天然材料成為用于組織修復(fù)及構(gòu)建三維細(xì)胞培養(yǎng)模型仿生設(shè)計的理想選擇。

殼聚糖(chitosan，CS)是繼纖維素后自然界中存在最多的天然多糖，由于其物化性質(zhì)、生物性能及理想的生物活性［5］而被認(rèn)為具有極高的生物醫(yī)用價值。殼聚糖基水凝膠因具有與軟組織相近的機(jī)械性能，其較低的界面張力使細(xì)胞易于跨越組織/植入體界面，同時其親水性的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸［6］而廣泛應(yīng)用于藥物控制釋放及細(xì)胞培養(yǎng)。但是，純粹的天然材料仍存有缺陷，無法滿足理想仿生設(shè)計的苛刻要求。

本研究將選擇具有一定流動及取向性的羥丙基纖維素酯類液晶與殼聚糖水凝膠復(fù)合，構(gòu)建仿生殼聚糖/液晶(chitosan/liquid crystal，CS/LC)復(fù)合水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)基體以調(diào)控細(xì)胞與生物材料界面的相互作用。本課題組前期研究結(jié)果已顯示，羥丙基纖維素酯與聚合物材料復(fù)合后，可在聚合物基體中自發(fā)形成液晶疇，而后與基質(zhì)材料構(gòu)成相分離，此結(jié)構(gòu)形態(tài)類似于生物膜的液晶態(tài)結(jié)構(gòu)因而呈現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性［7］。本文擬構(gòu)建殼聚糖/羥丙基纖維素酯液晶復(fù)合水凝膠，通過探索復(fù)合水凝膠的表面形貌及液晶與殼聚糖的相分離結(jié)構(gòu)，探究此仿生結(jié)構(gòu)及液晶相對細(xì)胞相容性的影響，研究結(jié)果將為此類新型仿生液晶態(tài)材料應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

CS(分子量350 000)購自Sigma，使用前純化;所用其它試劑均為分析純。2 種羥丙基纖維素酯由本實(shí)驗(yàn)室合成，即羥丙基纖維素辛酯(octyl hydroxypropyl cellulose ester，OPC;分子量93 700，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度16.5 ℃，熔融溫度132.5 ℃)和羥丙基纖維素丁酯(butyl hydroxypropyl cellulose ester，BPC;分子量92 300，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度18.49 ℃，熔融溫度156.3 ℃)［8］。液晶的化學(xué)合成過程如圖1所示。

Figure 1. The synthetic route of liquid crystal.圖1 液晶的合成途徑

殼聚糖脫乙酰度采用線性電位滴定法測量，結(jié)果測得脫乙酰度為67.36%。

2 物理交聯(lián)CS/LC 復(fù)合水凝膠的制備

稱取適量CS 粉末分散于與其氨基等當(dāng)量的鹽酸中進(jìn)行氨基質(zhì)子化作用，經(jīng)1 d 充分溶解后加入與鹽酸等質(zhì)量的1，2-丙二醇，充分混合1 d 獲得混合溶液，此時殼聚糖濃度為1%(m/m)。稱取一定質(zhì)量的BPC/OPC 溶于乙醇，CS∶LC(m/m)分別為1∶1、1∶2和1∶3(標(biāo)記為LC-1、LC-2 和LC-3)，用噴霧法將LC 混合液加入CS 溶液中并快速攪拌，將制得的混合溶液倒入模具中，在50 ℃環(huán)境下去除水和有機(jī)溶劑，得到殼聚糖/液晶復(fù)合醇凝膠。將所制凝膠在1 mol/L NaOH 溶液中浸泡1 d，大量去離子水充分清洗。

3 CS/LC 復(fù)合水凝膠的表征

3.1 X 射線衍射( X-ray diffraction，XRD) 分析 取一定質(zhì)量殼聚糖/液晶復(fù)合水凝膠，液氮冷凍后通過冷凍干燥機(jī)干燥，樣品壓片后用D/MAX-1200 型X射線衍射儀(Rigaku)進(jìn)行測試，以Cu 射線為射線源，掃描速度8°/min，步寬0.02°，掃描角度(2θ)為5～60°，分析樣品的結(jié)晶行為。

3.2 掃描電鏡( scanning electron microscope，SEM)觀察 將不同液晶含量的殼聚糖/液晶復(fù)合水凝膠膜用液氮冷凍后通過冷凍干燥機(jī)干燥，樣品噴金處理后用XL-30 ESEM 型掃描電子顯微鏡(Philips)觀察其表面微觀形貌特征。

4 細(xì)胞相容性研究

4.1 成纖維細(xì)胞活性測定 細(xì)胞活性測定選用改良的MTT 法。

BPC/OPC 制備成厚度約1 mm 膜，殼聚糖水凝膠以及各比例的殼聚糖/液晶復(fù)合水凝膠制成膜，經(jīng)過［60Co］滅菌后鋪于48 孔板底部，每組3 個平行樣本，無菌PBS 沖洗后種板。取凍存的3T3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，傳至第3 代后進(jìn)入對數(shù)生長期。0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心并加入培養(yǎng)基吹打獲得均勻的單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下通過血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液至1.5 ×107/L，以每孔500 μL 接種于材料上，每隔2 d 換1 次培養(yǎng)基。

細(xì)胞培養(yǎng)1 d、3 d、5 d 和7 d 后每孔加入100 μL MTT 并繼續(xù)在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，再加入500 μL 三聯(lián)液并繼續(xù)在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d后依次將混合液移入96 孔板中，在檢測波長570 nm、參考波長630 nm 處測量吸光度，所有操作需避光進(jìn)行。

4.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 BPC/OPC 膜，CS 水凝膠以及各比例的殼聚糖/液晶復(fù)合水凝膠膜的制備及材料表面3T3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)同上。細(xì)胞培養(yǎng)3 d 和6 d 后，PBS 沖洗3 次，2.5%戊二醛固定1 h，75 %、85 %、95 %和100 %梯度乙醇脫水后凍干進(jìn)行噴金處理，用XL-30 ESEM 型掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CS/LC 復(fù)合水凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖2 為不同比例的CS/LC(BPC 或OPC)復(fù)合水凝膠的SEM 照片，結(jié)果顯示，LC 均勻地分布在CS 基質(zhì)中聚集成液晶疇，與CS 形成“海-島”狀相分離結(jié)構(gòu)，類似生物膜的“流動鑲嵌模型”。隨著液晶含量增多，液晶疇密度增大。當(dāng)CS∶LC 質(zhì)量比達(dá)到1∶1時，液晶疇向外伸展，開始相互連接，但其尺寸保持在4 ～10 μm。

液晶態(tài)已被證明廣泛存在于生物體系中并通過非共價鍵相互作用進(jìn)行自發(fā)的有序排列［9］。本研究制備的CS/LC 復(fù)合水凝膠中鑲嵌的微米尺寸液晶疇，其呈現(xiàn)的有序結(jié)構(gòu)可視為活性位點(diǎn)，可作為組織工程活細(xì)胞界面。

Figure 2. SEM micrographs of the surface of CS/LC composite hydrogel. BPC-1(OPC-1)，BPC-2(OPC-2)and BPC-3(OPC-3)mean CS∶BPC(OPC)=1∶1，1∶2 and 1∶3 (m/m)，respectively.圖2 不同比例CS/LC 復(fù)合水凝膠表面的SEM 照片

2 CS/LC 復(fù)合水凝膠XRD 分析

CS/LC 復(fù)合水凝膠的XRD 譜圖如圖3 所示。結(jié)果顯示BPC 在2θ =7°和20°有2 個明顯的衍射峰，而CS/BPC 復(fù)合水凝膠的XRD 譜圖與純CS 水凝膠類似，無明顯的衍射峰。當(dāng)在CS 基質(zhì)中引入BPC后，由于受到CS 水凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的束縛，BPC無法自聚集形成較大的本體結(jié)構(gòu)而形成小而分散的BPC 疇，因此在XRD 譜圖中未見明顯的衍射峰，表明CS/BPC 復(fù)合水凝膠主要呈現(xiàn)非晶態(tài)。同樣，CS/OPC 復(fù)合水凝膠的XRD 譜圖也呈現(xiàn)類似的結(jié)果。

Figure 3. XRD patterns of CS/LC composite hydrogel.圖3 不同比例CS/LC 復(fù)合水凝膠XRD 譜圖

3 CS/LC 復(fù)合水凝膠的細(xì)胞相容性

3.1 細(xì)胞活性測定 圖4 顯示3T3 成纖維細(xì)胞在CS 水凝膠、CS/LC 復(fù)合水凝膠及純LC 膜表面培養(yǎng)不同周期(1、3、5、7 d)的細(xì)胞活性，組織培養(yǎng)板(tissue culture polystyrene，TCPS)作為空白對照組。結(jié)果顯示，3T3 細(xì)胞在CS/LC 復(fù)合水凝膠及TCPS 表面增殖情況相近，但優(yōu)于純LC 膜表面。體外培養(yǎng)1 d后，復(fù)合水凝膠表面的細(xì)胞增殖速率明顯高于TCPS及純LC 膜表面，這歸因于復(fù)合水凝膠具有的類軟組織黏彈性及液晶疇流動特性促進(jìn)了細(xì)胞的早期黏附。培養(yǎng)3 d 后，CS 水凝膠及CS/LC 復(fù)合水凝膠表面的細(xì)胞增殖率顯著增加，表明水凝膠體系對細(xì)胞增殖有很好的促進(jìn)作用。CS/OPC 復(fù)合水凝膠表面細(xì)胞的增殖速率明顯優(yōu)于CS/BPC 表面，這是由于OPC 大分子本身結(jié)構(gòu)中含有長而柔的側(cè)鏈，使CS/OPC 復(fù)合水凝膠的黏彈性更接近于軟組織［10］，這種可調(diào)的液晶剛-柔界面［11］可大大促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Figure 4. Cell viability tests on different CS/LC(BPC or OPC)composite hydrogels.TCPS:tissue culture polystyrene. Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs BPC or OPC group at the same time point.圖4 不同比例CS/LC 復(fù)合水凝膠的細(xì)胞活性測定

3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 圖5 顯示3T3 成纖維細(xì)胞在CS 水凝膠及不同比例CS/LC 復(fù)合水凝膠表面培養(yǎng)3 d 的細(xì)胞形態(tài)。SEM 觀察顯示細(xì)胞呈球形，且分泌出大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，細(xì)胞通過ECM 相互連接，表明細(xì)胞在材料表面呈現(xiàn)良好的生長狀態(tài)。圖6 顯示了細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)6 d的細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞在純LC 膜表面只是均勻地伸展，而在復(fù)合水凝膠上則彼此連接并覆蓋整個表面區(qū)域，表明細(xì)胞在復(fù)合水凝膠基質(zhì)上大量繁殖。與純CS 水凝膠相比較，細(xì)胞在CS/LC 表面分泌出更多的ECM，由此揭示復(fù)合水凝膠體系結(jié)構(gòu)中的CS 與LC之間產(chǎn)生協(xié)同作用，從而促進(jìn)了細(xì)胞的鋪展和增殖。

Figure 5. SEM photos of 3T3 cells cultured in vitro on composite hydrogels and CS hydrogel for 3 days. BPC-1(OPC-1)，BPC-2(OPC-2)and BPC-3(OPC-3)mean CS∶BPC(OPC)=1∶1，1∶2 and 1∶3 (m/m)，respectively.圖5 3T3 細(xì)胞在復(fù)合水凝膠以及CS 水凝膠表面體外培養(yǎng)的SEM 照片(3 d)

Figure 6. SEM photos of 3T3 cells cultured in vitro on composite hydrogels and CS hydrogel for 6 days. BPC-1(OPC-1)，BPC-2(OPC-2)and BPC-3(OPC-3)mean the CS∶BPC(OPC)=1∶1，1∶2 and 1∶3 (m/m)，respectively.圖6 3T3 細(xì)胞在復(fù)合水凝膠以及CS 水凝膠表面體外培養(yǎng)的SEM 照片(6 d)

討 論

CS 具有與人體黏多糖分子相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而CS 水凝膠具有類似于人體軟組織的黏彈性從而能促進(jìn)細(xì)胞的黏附和生長。在CS 基體中引入膽甾型液晶(BPC/OPC)可構(gòu)成具有相分離結(jié)構(gòu)的CS/LC復(fù)合水凝膠，其“海-島”狀表面形態(tài)類似于生物膜的“流體鑲嵌模型”，這種有序結(jié)構(gòu)可促進(jìn)細(xì)胞的早期黏附，并通過提供大量的活性位點(diǎn)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移及ECM 的分泌［12］。由于CS/LC 復(fù)合水凝膠結(jié)合了水凝膠類軟組織黏彈性及液晶有序性和流動性的特征，因而增進(jìn)了細(xì)胞與基質(zhì)界面之間的相互作用。同時疏水性LC 與親水性CS 之間通過相分離構(gòu)成的親-疏水平衡達(dá)到恰好適于細(xì)胞黏附和生長的程度［13］?；|(zhì)的黏彈性對細(xì)胞的相互接觸與黏附有重要影響，本研究中制備的CS/LC 復(fù)合水凝膠所具有的類軟組織黏彈性為細(xì)胞的生長提供了良好的環(huán)境。近年來，液晶在生物體系中的應(yīng)用得到越來越多的關(guān)注，其分子通過非共價鍵相互作用自發(fā)形成的有序排列和周期性結(jié)構(gòu)為生物科學(xué)的研究提供了理論基礎(chǔ)，亦為組織工程材料設(shè)計提供重要的策略。本研究選用具有有序結(jié)構(gòu)的液晶BPC/OPC構(gòu)建CS/LC 復(fù)合水凝膠體系，其中均勻分布于CS 基體中的液晶疇形成流動性的表面，類似于生物膜的特性，從而促進(jìn)了細(xì)胞與材料表面的相互作用。因此，同時具備類軟組織黏彈性及液晶有序性和流動性特征的CS/LC 復(fù)合水凝膠，有望成為活性生物材料在組織工程中作為活細(xì)胞界面。

本研究構(gòu)建的具有仿生結(jié)構(gòu)的CS/LC 復(fù)合水凝膠，當(dāng)LC 復(fù)合到CS 基體中，LC 自發(fā)形成液晶疇并均勻分布于具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水凝膠中，復(fù)合水凝膠體系主要呈現(xiàn)非晶態(tài)。LC 含量較低時，LC 在CS 基質(zhì)中形成物理交聯(lián)點(diǎn);隨著LC 含量的增多，液晶疇逐漸增大且在CS 基質(zhì)中形成島狀分布，與CS共同構(gòu)成類生物膜的“流體鑲嵌模型”。當(dāng)CS 與LC比例達(dá)到1∶1 時，LC 疇向外伸展彼此相連，但LC 疇尺寸仍保持在4 ～10 μm 范圍內(nèi)。細(xì)胞相容性研究表明，3T3 細(xì)胞在CS/LC 復(fù)合基質(zhì)表面呈現(xiàn)良好的黏附和增殖。培養(yǎng)3 d 和6 d 后，細(xì)胞完全覆蓋復(fù)合水凝膠表面并分泌大量的ECM，說明CS/LC 復(fù)合水凝膠體系中CS 與LC 產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)從而大大促進(jìn)細(xì)胞的生長。

本研究制備的CS/LC 復(fù)合水凝膠集類軟組織黏彈性及液晶有序性和流動性的特征于一體，有效增進(jìn)細(xì)胞與復(fù)合水凝膠界面間的相互作用。此類CS/LC 復(fù)合水凝膠仿生材料有望作為活性生物材料在組織工程中得到廣泛應(yīng)用。

［1］ Rahmany MB，Van Dyke M. Biomimetic approaches to modulate cellular adhesion in biomaterials:a review［J］.Acta Biomater，2013，9(3):5431-5437.

［2］ Bott K，Upton Z，Schrobback K，et al. The effect of matrix characteristics on fibroblast proliferation in 3D gels［J］. Biomaterials，2010，31(32):8454-8464.

［3］ Fedorovich NE，Alblas J，de Wijn JR，et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering:stateof-the-art and novel application in organ printing［J］. Tissue Eng，2007，13(8):1905-1925.

［4］ Han W，Tu M，Zeng R，et al. Preparation，characterization and cytocompatibility of polyurethane/cellulose based liquid crystal composite membranes ［J］. Carbohydr Polym，2012，90(3):1353-1361.

［5］ Liu Z，Wang H，Wang Y，et al. The influence of chitosan hydrogel on stem cell engraftment，survival and homing in the ischemic myocardial microenvironment［J］. Biomaterials，2012，33(11):3093-3106.

［6］ Zhang L，Li K，Xiao W，et al. Preparation of collagenchondroitin sulfate-hyaluronic acid hybrid hydrogel scaffolds and cell compatibility in vitro ［J］. Carbohydr Polym，2011，84(1):118-125.

［7］ Tu M，Han W，Zeng R，et al. A study of surface morphology and phase separation of polymer/cellulose liquid crystal composite membranes ［J］. Colloids Surfaces A Physicochem Eng Aspects，2012，407(5):126-132.

［8］ 龔 磊.羥丙基纖維素酯類液晶的合成及聚合物復(fù)合膜的細(xì)胞相容性研究［D］.廣州:暨南大學(xué)，2011.

［9］ Nagahama K，Ueda Y，Ouchi T，et al. Exhibition of soft and tenacious characteristics based on liquid crystal formation by introduction of cholesterol groups on biodegradable lactide copolymer ［J］. Biomacromolecules，2007，8(12):3938-3943.

［10］Zeng X，Li S. Multiscale modeling and simulation of soft adhesion and contact of stem cells［J］. J Mech Behav Biomed Mater，2011，4(2):180-189.

［11］ Rey AD. Mechanics of soft-solid-liquid-crystal interfaces［J］. Phys Rev E Stat Nonlin Matter Phys，2005，72(1):011706.

［12］Hwang JJ，Iyer SN，Li LS，et al. Self-assembling biomaterials:Liquid crystal phases of cholesteryl oligo(L-lactic acid)and their interactions with cells ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(15):9662-9667.

［13］Miyata T. Preparation of smart soft materials using molecular complexes［J］. Polymer J，2010，42(4):277-289.