• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Caveolae 在高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用*

    2013-12-23 06:26:44盧圣霞劉元濤杜月娟傅余芹
    中國(guó)病理生理雜志 2013年4期
    關(guān)鍵詞:系膜高糖磷酸化

    盧圣霞, 劉元濤, 孔 峰, 杜月娟, 劉 曄, 傅余芹△

    (山東大學(xué)第二醫(yī)院1腎臟內(nèi)科,2內(nèi)分泌科,3中心實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南250033;4濟(jì)南市中心醫(yī)院腎臟內(nèi)科,山東 濟(jì)南250013)

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一,以腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉積為其顯著的病理特點(diǎn),成為導(dǎo)致終末期腎病最主要的原因[1-2]。高血糖是導(dǎo)致DN 發(fā)病的一個(gè)主要因素,它通過(guò)激活多條信號(hào)通路,上調(diào)纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)及I型膠原(collagen type I,Col I)的表達(dá),最終導(dǎo)致ECM積聚[3-4]。Caveolae 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種富含膽固醇(cholesterol,Chol)及磷脂的胞膜小凹結(jié)構(gòu),caveolin是其標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白,廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上。研究表明,caveolae 為多種信號(hào)分子提供了一個(gè)聚集的場(chǎng)所,對(duì)于細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能具有重要調(diào)控作用[5-6]。腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells,MCs)是一種類平滑肌樣細(xì)胞,其細(xì)胞膜含有caveolae[6]。既往研究發(fā)現(xiàn),caveolae 在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ECM 分泌過(guò)程中具有重要作用[7],而高糖環(huán)境下caveolae 在腎小球系膜細(xì)胞ECM 合成中的作用目前尚不明確。本研究旨在探討caveolae 在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞ECM 合成中的作用與機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    大鼠腎小球系膜細(xì)胞(由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院易凡教授惠贈(zèng));DMEM 培養(yǎng)基和新生胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)均購(gòu)自Gibco;小凹蛋白1(caveolin-1,Cav-1)抗體購(gòu)自BD;磷酸化的小凹蛋白1(phosphorylated caveolin-1 on tyrosine 14,p-Cav-1-Y14)抗體購(gòu)自CST;Col I 抗體購(gòu)自Abcam;β-actin 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔Ⅱ抗和鼠Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司;FN ELISA 試劑盒購(gòu)自RD。Real-time PCR Ultra SYBR mixture 試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程總公司;RIPA、PMSF 和BCA 試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

    2 方法

    2.1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng) MCs 以(0.5 ~1)×106接種于DMEM 完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺),置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 ~3 d 換液,待細(xì)胞長(zhǎng)至90% 培養(yǎng)皿時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

    2.2 細(xì)胞分組及處理 培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合70% ~80%后用無(wú)血清低糖DMEM 培養(yǎng)基同步化24 h,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行如下分組及處理:(1)正常糖(normal glucose,NG)組(5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇);(2)高糖(high glucose,HG)HG 組(30 mmol/L 葡萄糖);各組繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞0、12、24 和48 h。為觀察高糖誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的劑量效應(yīng),不同濃度的葡萄糖(5.5、16.7 和30.0 mmol/L)分別處理細(xì)胞1 h,各組滲透壓均用甘露醇調(diào)整至30.0 mmol/L 以避免滲透壓不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾(5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇;16.7 mmol/L 葡萄糖+13.3 mmol/L 甘露醇)。為觀察高糖誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的時(shí)間效應(yīng),選取作用效果最明顯的30.0 mmol/L 葡萄糖短時(shí)處理細(xì)胞0~4 h。同步化的細(xì)胞經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精(methyl-βcyclodextrin,β-MCD;5 mmol/L)預(yù)處理1 h 后再分為2 組:β-MCD+HG 組(5 mmol/L β-MCD + 30 mmol/L 葡萄糖);β-MCD+HG+Chol 組(5 mmol/L β-MCD+ 30 mmol/L 葡萄糖+ 15 mg /L Chol),各組繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1、12、24 和48 h,按照各處理組指定時(shí)間收集細(xì)胞及上清,進(jìn)行分析。

    2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 以TRIzol 抽提處理后的細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR Green 嵌合熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,反應(yīng)體系25 μL,上、下游引物均由大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)設(shè)計(jì)合成(表1),反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;55℃~60 ℃,34 s;同時(shí)獲取熒光,共40 個(gè)循環(huán),每組重復(fù)6 次,反應(yīng)結(jié)束后行產(chǎn)物的熔解曲線分析,以GAPDH 為內(nèi)參照進(jìn)行結(jié)果分析。

    表1 實(shí)時(shí)定量PCR 的引物序列Table 1. Real-time PCR primer sequences

    2.4 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中FN 蛋白含量 取不同處理因素作用0、12、24 和48 h 的細(xì)胞上清液,6 000 r/min 4 ℃離心10 min,收集上清,每組重復(fù)3次,后續(xù)操作按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零,直接測(cè)定其吸光度(A),并由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算成各蛋白的濃度值。

    2.5 Western blotting 細(xì)胞處理不同時(shí)點(diǎn)后,棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷PBS 洗3 遍,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。等量細(xì)胞蛋白(60 μg)加5 ×loading buffer 煮沸變性10 min,10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至NC 膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,Ⅰ抗[Cav-1(1 ∶2 000);p-Cav-1-Y14(1∶1 000);Col I(1∶1 000);β-actin (1∶1 000)]4 ℃孵育過(guò)夜,NC 膜用TBST 緩沖液洗3 遍后,再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h 后顯影。免疫復(fù)合物用ECL 方法檢測(cè),電泳條帶用ImageJ 軟件分析灰度值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示,組間比較及顯著性檢驗(yàn)采用One-way ANOVA 檢驗(yàn),以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 高糖對(duì)系膜細(xì)胞FN 和Col I 蛋白表達(dá)的影響

    與NG 組相比,高糖培養(yǎng)24 h 細(xì)胞FN 濃度顯著增加(P <0.05),48 h 達(dá)到高峰,見(jiàn)圖1。與HG 0 h組相比,高糖培養(yǎng)12 h 細(xì)胞Col I 蛋白表達(dá)明顯增多(P <0.05),48 h 達(dá)到高峰,見(jiàn)圖2。

    Figure 1. Quantitative analysis of the FN level induced by high glucose (30 mmol/L). Mean ±SD. n =3. * P <0.05 vs NG group.圖1 高糖(30 mmol/L)對(duì)系膜細(xì)胞FN 蛋白水平的定量分析

    Figure 2. The effect of high glucose (30 mmol/L)on expression of Cav-1 and Col I. Mean ± SD. n =3. * P <0.05 vs HG 0 h group.圖2 高糖(30 mmol/L)對(duì)系膜細(xì)胞Col I 和Cav-1 蛋白表達(dá)的影響

    2 高糖對(duì)系膜細(xì)胞Cav-1 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

    高糖處理系膜細(xì)胞,各時(shí)點(diǎn)Cav-1 mRNA 及蛋白表達(dá)量較HG 0 h 組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P >0.05),見(jiàn)圖2、3。

    Figure 3. The effect of high glucose (30 mmol/L)on Cav-1 mRNA expression.Mean±SD.n=3.圖3 高糖(30 mmol/L)對(duì)系膜細(xì)胞Cav-1 mRNA 表達(dá)的影響

    3 高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Cav-1 磷酸化水平的影響

    以p-Cav-1-Y14 與Cav-1 灰度比值作為Cav-1 磷酸化水平的指標(biāo)進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示:不同濃度(5.5、16.7 和30 mmol/L)葡萄糖處理MCs,Cav-1 磷酸化水平呈現(xiàn)濃度依賴性升高(P <0.01),見(jiàn)圖4;30 mmol/L 高糖處理后,Cav-1 磷酸化水平于0.5 h即可出現(xiàn)升高,1 h 達(dá)到高峰,之后磷酸化水平逐漸下降(P <0.01),見(jiàn)圖5。

    4 甲基-β-環(huán)糊精及膽固醇對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Cav-1 磷酸化水平的影響

    與單純HG(30 mmol/L)組相比,β-MCD(預(yù)處理1 h)+HG(30 mmol/L,1 h)組Cav-1 磷酸化水平明顯下降(P <0.01);而β-MCD + HG + Chol(15 mg/L)組Cav-1 磷酸化水平較β-MCD +HG 組顯著升高(P <0.01),見(jiàn)圖6。

    Figure 4. Phosphorylation of Cav-1 induced by high glucose at different concentrations.Mean±SD.n=3. **P <0.01 vs NG (5.5 mmol/L)group;##P <0.01 vs HG (16.7 mmol/L)group.圖4 高糖誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的劑量效應(yīng)

    Figure 5. Phosphorylation of Cav-1 induced by high glucose(30 mmol/L)at different time points. Mean ± SD. n =3.**P <0.01 vs HG 0 h group.圖5 高糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的時(shí)間效應(yīng)

    Figure 6. Effects of β-MCD(5 mmol/L)and cholesterol(15 mg/L)on phosphorylation of Cav-1.Mean±SD.n=3. **P <0.01 vs NG group;##P <0.01 vs HG group;△△P <0.01 vs HG+β-MCD group.圖6 甲基-β-環(huán)糊精(5 mmol/L)及膽固醇(15 mg/L)對(duì)系膜細(xì)胞Cav-1 磷酸化的影響

    5 甲基-β-MCD 及膽固醇對(duì)細(xì)胞FN 及Col-1 蛋白表達(dá)的影響

    與單純HG 組相比,HG +β-MCD 組各時(shí)點(diǎn)FN的濃度均顯著降低(均P <0.05),見(jiàn)圖7;與HG+β-MCD 組相比,HG+β-MCD+ Chol 組各時(shí)點(diǎn)FN 濃度均明顯升高(均P <0.05),見(jiàn)圖7。各時(shí)點(diǎn)Col-1 蛋白表達(dá)量在HG、HG + β-MCD 及HG + β-MCD +Chol 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P >0.05),圖8 為各組處理細(xì)胞48 h 后的結(jié)果。

    討 論

    Caveolae 是具有燒瓶底型凹陷形態(tài)的特殊脂筏結(jié)構(gòu),廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上[6]。在腎臟,caveolae 主要存在于腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞[5-6]。Cav-1 是caveolae 的標(biāo)志性蛋白,對(duì)維持caveolae 結(jié)構(gòu)和功能的完整起關(guān)鍵作用[8]。目前已知,caveolae 參與細(xì)胞分化、增殖、腫瘤、炎癥、衰老等多種病理生理過(guò)程,對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有重要的意義[9]。既往研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1 表達(dá)明顯升高,而Cav-1 表達(dá)升高可抑制eNOS 活性,使NO 合成減少[10],這可能是糖尿病腎病的重要發(fā)病機(jī)制之一。至于糖尿病狀態(tài)下,腎小球系膜細(xì)胞Cav-1 表達(dá)的變化及其在糖尿病腎病中的病理意義目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞FN 和Col I mRNA 及蛋白水平明顯升高,這與既往的研究結(jié)果一致[11]。為探討caveolae在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞ECM合成中的作用,我們觀察了高糖對(duì)Cav-1 表達(dá)的影響,結(jié)果顯示高糖對(duì)Cav-1 的mRNA 及蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。

    Figure 8. The effect of β-MCD (5 mmol/L)and cholesterol (15 mg/L)on Col I expression. Mean ±SD. n =3. * P <0.05 vs NG group.圖8 甲基-β-環(huán)糊精(5 mmol/L)及膽固醇(15 mg/L)對(duì)系膜細(xì)胞Col-1 表達(dá)的影響

    最初,Cav-1 是以其酪氨酸磷酸化的形式,作為Src 激酶的磷酸化底物被首次發(fā)現(xiàn)[12]。業(yè)已證實(shí),位于Cav-1 的N 末端酪氨酸14 位點(diǎn)是其主要磷酸化位點(diǎn)[13]。除Src 之外,多種細(xì)胞因子(如血小板衍生因子、上皮生長(zhǎng)因子、胰島素等)也能夠引起該位點(diǎn)的磷酸化。p-Cav-1-Y14 被認(rèn)為是Cav-1 的活化形式,可與多種信號(hào)蛋白交聯(lián),實(shí)現(xiàn)信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),高糖狀態(tài)下Cav-1 蛋白表達(dá)雖無(wú)變化,但其磷酸化水平顯著升高,且與FN 表達(dá)密切相關(guān)。

    Caveolae 結(jié)構(gòu)中富含膽固醇,而膽固醇對(duì)維持caveolae 結(jié)構(gòu)和功能是必需的。β-MCD 是一種細(xì)胞外膽固醇受體,對(duì)膽固醇有很高的親和力,可以去除胞膜中的膽固醇,特異性干擾caveolae 形成而不對(duì)胞膜的完整性造成影響[16-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),β-MCD 預(yù)處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的Cav-1 磷酸化,同時(shí)導(dǎo)致FN 合成減少,但對(duì)高糖誘導(dǎo)的Col I 表達(dá)無(wú)顯著影響。以上結(jié)果提示,高糖誘導(dǎo)的Cav-1 磷酸化有賴于caveolae 結(jié)構(gòu)的完整,而磷酸化的Cav-1 可能介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的FN 合成,但對(duì)高糖誘導(dǎo)的Col I 合成無(wú)介導(dǎo)作用。以上結(jié)果提示高糖通過(guò)多種信號(hào)途徑對(duì)不同細(xì)胞外基質(zhì)的合成進(jìn)行調(diào)控。

    總之,本研究結(jié)果提示caveolae 及其結(jié)構(gòu)蛋白Cav-1 在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞FN 的合成過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用。關(guān)于高糖狀態(tài)下Cav-1 磷酸化的發(fā)生機(jī)制以及磷酸化的Cav-1 如何調(diào)節(jié)FN 合成尚待進(jìn)一步研究。

    [1] 周 群,宋菊敏,陳衛(wèi)星,等.糖尿病性微血管病的臨床病理生理[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2007,23(2):399-402.

    [2] 方華偉,傅玉芹,韓亞麗,等.組織蛋白酶B 和胱抑素C在糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(7):1399-1403.

    [3] Hayashi K,Wakino S,Kanda T,et al. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:role of Rho-kinase in the development of renal injury[J].Pharmacol Sci,2006,100(1):29-33.

    [4] Zeng L,Xu H,Chew TL,et al.HMG CoA reductase inhibition modulates VEGF-induced endothelial cell hyperpermeability by preventing RhoA activation and myosin regulatory light chain phosphorylation[J]. FASEB J,2005,19(13):1845-1847.

    [5] Percy CJ,Pat BK,Healy H,et al.Phosphorylation of caveolin-1 is anti-apoptotic and promotes cell attachment during oxidative stress of kidney cells[J]. Pathology,2008,40(7):694-701.

    [6] Tamai O,Oka N,Kikuchi T,et al. Caveolae in mesangial cells and caveolin expression in mesangial proliferative glomerulonephritis[J].Kidney Int,2001,59(2):471-480.

    [7] Wang XM,Zhang Y,Kim HP,et al. Caveolin-1:a critical regulator of lung fibrosis in idiopathic pulmonary fibrosis[J].J Exp Med,2006,203(13):2895-2906.

    [8] Couet J,Li S,Okamoto T,et al. Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain.Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins[J]. J Biol Chem,1997,272(10):6525-6533.

    [9] Schwencke C,Braun-Dullaeus RC,Wunderlish C,et al.caveolae and caveolin in transmembrane signaling:implications for human disease[J]. Cardiovasc Res,2006,70(1):42-49.

    [10]Chen Z,Bakhshi FR,Shajahan AN,et al. Nitric oxide-dependent Src activation and resultant caveolin-1 phosphorylation promote eNOS/caveolin-1 binding and eNOS inhibition[J].Mol Biol Cell,2012,23(7):1388-1398.

    [11]Marks JB,Raskin P.Nephropathy and hypertension in diabetes[J].Med Clin North Am,1998,82(4):877-907.

    [12]Bharat J,Michele B,Scott SS,et al.Phosphocaveolin-1 is a mechanotransducer that induces caveola biogenesis via Egr1 transcriptional regulation[J].J Cell Biol,2012,199(3):425-435.

    [13]Li S,Seitz R,Lisanti MP.Phosphorylation of caveolin by Src tyrosine kinases:the α-isoform of caveolin is selectively phosphorylated by v-Src in vivo[J]. J Biol Chem,1996,271(7):3863-3868.

    [14]Sargiacomo M,Sudol M,Tang ZL,et al. Signal transducing molecules and glycosylphosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells[J].J Cell Biol,1994,126(1):111-126.

    [15]Lisanti MP,Scherer PE,Vidugiriene J,et al. Characterization of caveolin-rich membrane domains isolated from an endothelial-rich source:implications for human disease[J].J Cell Biol,1994,126(1):111-126.

    [16]Chintagari NR,Jin N,Wang P,et al.Effect of cholesterol depletion on exocytosis of alveolar typeⅡcells[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34(6):677-687.

    [17]蕈 麗,廖端芳.Caveolae/caveolin-1 與細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)[J].中國(guó)病理生理雜志,2007,10(4):2067-2070.

    猜你喜歡
    系膜高糖磷酸化
    白藜蘆醇改善高糖引起腎小球系膜細(xì)胞損傷的作用研究
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    丹紅注射液對(duì)高糖引起腹膜間皮細(xì)胞損傷的作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
    腹腔鏡下直腸癌系膜全切除和盆腔自主神經(jīng)的關(guān)系
    MAPK抑制因子對(duì)HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    腎小球系膜細(xì)胞與糖尿病腎病
    張掖市甜菜高產(chǎn)高糖栽培技術(shù)
    大黃素對(duì)高糖培養(yǎng)的GMC增殖、FN表達(dá)及p38MAPK的影響
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    亚洲国产精品合色在线| 精品第一国产精品| 久久性视频一级片| 国产伦人伦偷精品视频| 露出奶头的视频| 91精品三级在线观看| 日韩欧美三级三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩精品免费视频一区二区三区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久青草综合色| 看免费av毛片| 免费观看精品视频网站| 黄色女人牲交| 老司机靠b影院| 亚洲五月色婷婷综合| 又黄又粗又硬又大视频| 香蕉久久夜色| 中文字幕精品免费在线观看视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 搞女人的毛片| 咕卡用的链子| 国产精品亚洲美女久久久| 麻豆一二三区av精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 我的亚洲天堂| 人人澡人人妻人| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲 国产 在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 欧美日韩精品网址| 国产精品亚洲一级av第二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品福利观看| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美成人午夜精品| 国产亚洲av高清不卡| 激情视频va一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男人舔女人的私密视频| 成人国产一区最新在线观看| 韩国精品一区二区三区| 丁香欧美五月| 久久狼人影院| 宅男免费午夜| 在线天堂中文资源库| 色精品久久人妻99蜜桃| 天天添夜夜摸| 天天添夜夜摸| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲五月天丁香| 后天国语完整版免费观看| bbb黄色大片| www国产在线视频色| 男女下面进入的视频免费午夜 | 电影成人av| 午夜福利免费观看在线| 极品教师在线免费播放| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲在线自拍视频| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕久久专区| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 午夜免费成人在线视频| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲色图av天堂| 国产成+人综合+亚洲专区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 女性被躁到高潮视频| 手机成人av网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成年版毛片免费区| 少妇 在线观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 少妇 在线观看| 久久香蕉精品热| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲电影在线观看av| 嫩草影视91久久| 制服人妻中文乱码| 亚洲免费av在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 99久久综合精品五月天人人| 精品第一国产精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 真人做人爱边吃奶动态| 热re99久久国产66热| 老司机深夜福利视频在线观看| 一本综合久久免费| 日韩国内少妇激情av| 黄色成人免费大全| 中文亚洲av片在线观看爽| 男人舔女人的私密视频| 亚洲 国产 在线| 国产xxxxx性猛交| 国产精品一区二区三区四区久久 | 一级毛片女人18水好多| 日韩欧美国产在线观看| 中文字幕久久专区| 欧美日本视频| 午夜激情av网站| 亚洲电影在线观看av| 在线观看66精品国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品,欧美在线| 午夜福利免费观看在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费看十八禁软件| 国产熟女午夜一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲三区欧美一区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日韩高清综合在线| 无人区码免费观看不卡| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 免费人成视频x8x8入口观看| 黄片大片在线免费观看| 69精品国产乱码久久久| 久久这里只有精品19| 国产成人啪精品午夜网站| 9191精品国产免费久久| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜福利一区二区在线看| 露出奶头的视频| 免费看十八禁软件| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日韩欧美国产在线观看| 国产熟女xx| 色哟哟哟哟哟哟| 国产高清激情床上av| 亚洲av电影在线进入| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产单亲对白刺激| 中文字幕高清在线视频| 午夜激情av网站| 一区二区三区高清视频在线| 国产男靠女视频免费网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美日韩乱码在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲av电影不卡..在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| av视频在线观看入口| 久久九九热精品免费| 日韩有码中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产视频一区二区在线看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产午夜精品久久久久久| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久精品国产欧美久久久| 香蕉久久夜色| 日韩免费av在线播放| 黄色女人牲交| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 男人操女人黄网站| 久久草成人影院| 色综合婷婷激情| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品久久久人人做人人爽| 91av网站免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品 欧美亚洲| 老司机深夜福利视频在线观看| 91字幕亚洲| 久久精品影院6| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品二区激情视频| 18禁美女被吸乳视频| 99香蕉大伊视频| 久久人妻av系列| 免费无遮挡裸体视频| 成人国产一区最新在线观看| 黄片小视频在线播放| cao死你这个sao货| 亚洲免费av在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄色视频不卡| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲人成电影免费在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日本视频| 在线观看www视频免费| 在线观看免费视频网站a站| 一级黄色大片毛片| 亚洲电影在线观看av| 美女午夜性视频免费| 成在线人永久免费视频| 午夜精品在线福利| 日本三级黄在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一区二区三区高清视频在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品国产乱码久久久久久男人| tocl精华| www.熟女人妻精品国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 俄罗斯特黄特色一大片| 无人区码免费观看不卡| 看片在线看免费视频| 岛国在线观看网站| av中文乱码字幕在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 制服诱惑二区| 男女之事视频高清在线观看| 成人国语在线视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费在线观看影片大全网站| 在线观看一区二区三区| av视频在线观看入口| bbb黄色大片| 丝袜美足系列| 动漫黄色视频在线观看| 久热这里只有精品99| av网站免费在线观看视频| 国产亚洲欧美98| 久久 成人 亚洲| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频 | 此物有八面人人有两片| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品久久视频播放| 精品国产一区二区久久| 中文字幕久久专区| 黄色成人免费大全| 午夜福利欧美成人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 女人精品久久久久毛片| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产在线观看jvid| 亚洲性夜色夜夜综合| 男人操女人黄网站| 国产亚洲欧美精品永久| 激情在线观看视频在线高清| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久久大精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 亚洲av成人一区二区三| 欧美日韩黄片免| 精品乱码久久久久久99久播| 一本久久中文字幕| 高清在线国产一区| 精品不卡国产一区二区三区| 啦啦啦免费观看视频1| 美女高潮到喷水免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲在线自拍视频| 欧美精品亚洲一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜免费鲁丝| 精品国产亚洲在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 老鸭窝网址在线观看| 少妇的丰满在线观看| 久久精品国产综合久久久| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美黄色淫秽网站| 黄色毛片三级朝国网站| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av第一区精品v没综合| 中出人妻视频一区二区| 亚洲专区字幕在线| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 中文字幕最新亚洲高清| 国产视频一区二区在线看| 男人舔女人下体高潮全视频| 极品教师在线免费播放| 老鸭窝网址在线观看| 中出人妻视频一区二区| 女同久久另类99精品国产91| 久久天堂一区二区三区四区| 夜夜爽天天搞| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产成人系列免费观看| 久久久精品欧美日韩精品| 香蕉丝袜av| 久久香蕉激情| 亚洲avbb在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 窝窝影院91人妻| 国产精品免费视频内射| av在线播放免费不卡| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲avbb在线观看| 亚洲三区欧美一区| 天天添夜夜摸| 免费不卡黄色视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产成人精品在线电影| 在线永久观看黄色视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久香蕉精品热| 国产亚洲精品第一综合不卡| 90打野战视频偷拍视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 成人三级做爰电影| 黑人操中国人逼视频| 精品电影一区二区在线| 长腿黑丝高跟| 中文字幕人妻熟女乱码| 少妇的丰满在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产三级在线视频| 丝袜美腿诱惑在线| 一进一出抽搐动态| 老司机午夜福利在线观看视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲久久久国产精品| 久久久久九九精品影院| 欧美中文日本在线观看视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久天堂一区二区三区四区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 后天国语完整版免费观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 9热在线视频观看99| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久热爱精品视频在线9| 欧美日本亚洲视频在线播放| 在线观看一区二区三区| 宅男免费午夜| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 很黄的视频免费| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费在线观看日本一区| 男男h啪啪无遮挡| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 成人三级做爰电影| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人欧美大片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲全国av大片| 黄色女人牲交| 久久欧美精品欧美久久欧美| 999久久久国产精品视频| 99热只有精品国产| 午夜福利在线观看吧| 国产精品亚洲av一区麻豆| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品在线美女| av欧美777| 黄色视频,在线免费观看| 性欧美人与动物交配| 亚洲成人免费电影在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产熟女xx| av视频免费观看在线观看| 国产精品九九99| 精品熟女少妇八av免费久了| 男男h啪啪无遮挡| 久久国产精品男人的天堂亚洲| cao死你这个sao货| 国产在线精品亚洲第一网站| 涩涩av久久男人的天堂| 久久人妻熟女aⅴ| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲三区欧美一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩高清综合在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丁香欧美五月| 一区在线观看完整版| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| www国产在线视频色| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品一区二区免费欧美| 一区二区三区高清视频在线| 黄色视频,在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费高清视频大片| bbb黄色大片| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品二区激情视频| 一本久久中文字幕| av天堂久久9| 亚洲全国av大片| 久久久久国内视频| 中文字幕av电影在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 中国美女看黄片| 欧美久久黑人一区二区| av中文乱码字幕在线| 国产成人精品久久二区二区91| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲色图av天堂| 午夜福利,免费看| 中亚洲国语对白在线视频| 久久性视频一级片| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲av一区综合| 精品国产三级普通话版| 制服丝袜大香蕉在线| 三级毛片av免费| 亚洲在线自拍视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 1024手机看黄色片| 九九爱精品视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 精品久久久久久,| 色哟哟·www| 成年人黄色毛片网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲电影在线观看av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精华一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲熟妇熟女久久| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩国产亚洲二区| 成年女人永久免费观看视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费在线观看影片大全网站| a在线观看视频网站| 在线国产一区二区在线| 免费高清视频大片| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品野战在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜福利在线在线| 亚洲欧美清纯卡通| 婷婷精品国产亚洲av| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产综合懂色| av在线观看视频网站免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲第一电影网av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费观看人在逋| av在线亚洲专区| 亚洲精品色激情综合| 天堂影院成人在线观看| 波多野结衣高清无吗| www.www免费av| 黄色日韩在线| 极品教师在线免费播放| 人人妻人人看人人澡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本三级黄在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久国产成人免费| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品国产成人久久av| av黄色大香蕉| 久久国产乱子免费精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美最黄视频在线播放免费| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美日韩黄片免| 我要看日韩黄色一级片| 黄色欧美视频在线观看| 久久久久久久久久黄片| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区二区三区av在线 | 91麻豆av在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| www.www免费av| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 精品国产三级普通话版| 在线免费观看不下载黄p国产 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人无遮挡网站| 国产乱人伦免费视频| 国产黄色小视频在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 天美传媒精品一区二区| 人人妻人人看人人澡| 舔av片在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲最大成人av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 中文字幕久久专区| 高清日韩中文字幕在线| 又爽又黄a免费视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99久国产av精品| 色在线成人网| 国产精华一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 日本a在线网址| 久久久久久久久中文| 国产亚洲91精品色在线| 真实男女啪啪啪动态图| 少妇人妻一区二区三区视频| bbb黄色大片| 久久热精品热| 毛片女人毛片| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费观看人在逋| 亚洲三级黄色毛片| 深夜精品福利| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清激情床上av| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲精品色激情综合| 精品久久久久久久久久免费视频| 哪里可以看免费的av片| 赤兔流量卡办理| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲欧美日韩东京热| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品一区二区三区四区久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 搞女人的毛片| 欧美成人a在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av免费高清在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品久久久久久,| 欧美高清性xxxxhd video| 久久久久久久久大av| 免费在线观看日本一区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩国内少妇激情av| 久久午夜福利片| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲成人中文字幕在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 天美传媒精品一区二区| 国产乱人伦免费视频| 免费观看的影片在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲欧美激情综合另类| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品永久免费网站| 变态另类丝袜制服| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品三级大全| 日韩欧美在线乱码|