四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻光合活性及毒素產(chǎn)生與釋放的影響

方 麗， 劉文清， 趙南京， 段靜波， 王志剛,2， 肖 雪， 張玉鈞， 劉 晶， 殷高方,石朝毅

(1. 中國科學(xué)院環(huán)境光學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所， 合肥 230031；2. 揚(yáng)州大學(xué)揚(yáng)子津校區(qū)環(huán)境學(xué)院,揚(yáng)州 225127)

湖泊富營養(yǎng)化日益加劇，隨之而來的藍(lán)藻水華成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)環(huán)境問題。水華暴發(fā)會(huì)進(jìn)一步加劇水體污染，帶來更嚴(yán)重的危害，如造成水體惡臭，產(chǎn)生毒素等，給飲用水處理造成困難。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是全球藍(lán)藻水華的常見藻種之一，屬于藍(lán)藻門藍(lán)藻綱微囊藻科。細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，為單細(xì)胞個(gè)體或群體，群體種類在細(xì)胞壁外分泌果膠類物質(zhì)構(gòu)成膠質(zhì)鞘膜[1]。它產(chǎn)生的微囊藻毒素(MCs)是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物，對(duì)哺乳動(dòng)物、魚類、鳥類以及無脊椎動(dòng)物皆有毒性[2]。據(jù)報(bào)道，微囊藻毒素有60多種同分異構(gòu)體，其中微囊藻毒素LR(MC-LR)就是最常見的三種之一。長期以來，各國學(xué)者對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行了大量的研究報(bào)道，包括其生長、產(chǎn)毒和環(huán)境影響因子等方面。四尾柵藻(Scenedesmusquadricanda)隸屬于綠藻門綠藻綱綠球藻目柵藻科，為不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞，通常由2、4或8個(gè)細(xì)胞組成。已有報(bào)道從競爭的角度研究銅綠微囊藻的產(chǎn)毒機(jī)理。許秋瑾[3]等的研究結(jié)果表明存在競爭時(shí)，銅綠微囊藻比單種培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生更多的毒素。萬蕾等[4]研究了不同營養(yǎng)條件下，銅綠微囊藻與四尾柵藻的競爭實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明在貧營養(yǎng)水平下柵藻能夠刺激微囊藻生長，富營養(yǎng)水平下，競爭抑制作用與N/P 有關(guān)，在較低氮磷濃度的水體中，微囊藻容易成為優(yōu)勢種，而在較高氮磷濃度的水體中，四尾柵藻更容易成為優(yōu)勢種。張坤等[5]研究了5種微藻對(duì)銅綠微囊藻生長的影響。結(jié)果表明5種微藻的初始密度對(duì)銅綠微囊藻的生長有顯著影響。當(dāng)銅綠微囊藻初始密度較小時(shí)，微藻密度增加對(duì)銅綠微囊藻生長抑制效果越明顯，而當(dāng)銅綠微囊藻的初始密度較高時(shí)，5種微藻密度的增加對(duì)銅綠微囊藻生長抑制效果不明顯。Fogg等[5]研究發(fā)現(xiàn)藻類在生長發(fā)育過程中會(huì)不斷向周圍環(huán)境中釋放碳水化合物、酶、脂類、抑制或促進(jìn)因子、毒素等來影響水體中其他藻類的生長發(fā)育。Piazzi 等[6]研究了2種微藻種內(nèi)和種間競爭，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞密度較低時(shí)，2種微藻競爭不明顯，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞密度變大，微藻間的抑制作用變得明顯，培養(yǎng)后期的競爭可能是因?yàn)榭臻g和營養(yǎng)資源缺乏。

由于藻類是光合自養(yǎng)生物，光合作用很重要，藻類各種結(jié)構(gòu)和生理過程都影響生長，但與生長關(guān)系最密切的是光合作用[7]，研究藻類生物量與光合作用活性之間的關(guān)系，通過監(jiān)測藻類熒光預(yù)知其生長潛能，對(duì)水華預(yù)警有重要意義。本實(shí)驗(yàn)選擇產(chǎn)MC-LR的銅綠微囊藻與不產(chǎn)該種毒素的四尾柵藻為實(shí)驗(yàn)藻種，進(jìn)行了為期58天的檢測分析，研究了四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻毒素MC-LR產(chǎn)生與釋放的影響，以及光合作用活性與生物量的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究野外混合藻的生長與產(chǎn)毒打下基礎(chǔ)，以及為通過活性預(yù)警藍(lán)藻水華提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)分析過程中用到的儀器主要包括：防交叉干擾自動(dòng)固相萃取裝置(美國sigma公司)； C18固相萃取小柱(500 mg/3 mL supelco En-vi小柱)；Agilent 1200高效液相色譜儀；Eclipse XDB-C18色譜柱；水樣熒光儀(WATER-PAM，walz,Germany)；HP400G型智能光照培養(yǎng)箱(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；Molecular超純水機(jī)；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器；迷你水浴鍋(W1106-230)；H-1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；NMT-2800氮吹儀(天津奧特塞恩斯)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀CounterStar(上海睿鈺生物科技有限公司)。

實(shí)驗(yàn)所用試劑主要有：甲醇(色譜純)；三氟乙酸(色譜純)；去離子水；純凈水；磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L)；

標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制：MC-LR標(biāo)準(zhǔn)樣品購于北京伊普瑞斯公司。用20%甲醇(分析純)將標(biāo)準(zhǔn)毒素配制成50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0 μg/mL，采用HPLC進(jìn)行分析，以測量標(biāo)準(zhǔn)樣品譜線峰面積與其對(duì)應(yīng)的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

液相色譜條件：色譜柱溫度40 ℃；流動(dòng)相為甲醇與磷酸鹽緩沖溶液按體積比57∶43混合；檢測器為二極管陣列檢測器波長238 nm；流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL[8]。

圖1 微囊藻毒素LR標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用銅綠微囊藻(FACHB-905)及四尾柵藻(FACHB-1297)購自中科院水生所。取60個(gè)滅菌的250 mL錐形瓶，分別加入130 mL已滅菌的BG-11培養(yǎng)基及3 mL(2.5×105個(gè)/mL)對(duì)數(shù)生長期的銅綠微囊藻。分為A，B兩組，每組30瓶 ，向B組錐形瓶中分別加入3 mL(2.5×105個(gè)/mL)對(duì)數(shù)生長期的四尾柵藻。兩組藻在培養(yǎng)箱中隨機(jī)放置，每天搖動(dòng)一次并隨機(jī)交換位置。在光照度3000 lx、溫度為25 ℃、光暗比為14 h/10 h下培養(yǎng)(在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，該條件下四尾柵藻及銅綠微囊藻在BG-11培養(yǎng)基中均能很好的生長)。每隔2 d測定藻細(xì)胞數(shù)、胞外毒素MC-LR、胞內(nèi)毒素MC-LR及光合活性，每次2個(gè)平行樣，后期藻生長緩慢，采樣間隔適當(dāng)增大。

1.3 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

分別取1 mL樣品于250 mL錐形瓶中，用去離子水稀釋至100 mL，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別計(jì)數(shù)兩種藻活細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.4 胞外毒素MC-LR測定

分別取100 mL藻液，離心分離藻細(xì)胞，上清液過0.45 μm玻璃纖維醋酸酯膜后固相萃取，依次用10 mL純水、10 mL20%甲醇淋洗，再用5 mL 90%甲醇(含0.1%三氟乙酸)洗脫[9]。洗脫液在40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇將吹干物轉(zhuǎn)移至HPLC進(jìn)樣瓶中(分兩次，每次0.5 mL)。再次氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇定容至200 μL，待測。測定結(jié)果以藻液體積歸一化，轉(zhuǎn)化成錐形瓶中的毒素濃度。計(jì)算公式如下：

其中，c為錐形瓶中毒素MC-LR濃度，單位μg/L；X為測得的色譜進(jìn)樣瓶中的MC-LR濃度，單位μg/mL；0.2為定容體積200 μL；100為藻液體積100 mL。

1.5 胞內(nèi)毒素MC-LR測定

上述離心后的藻細(xì)胞用去離子水轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，沸水浴處理20 min[10-11]，提取毒素，離心，取上清液，殘?jiān)萌ルx子水洗滌一次，離心，合并上清液。其余處理同細(xì)胞外毒素。為了方便對(duì)比，最終以藻液體積歸一化內(nèi)毒素水平，單位為μg/L。

1.6 光合活性測定

藻的光合作用活性以葉綠素a熒光表示。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)利用植物體內(nèi)葉綠素作為天然探針，研究和探測細(xì)胞光合生理狀況及各種外界環(huán)境因子對(duì)其細(xì)微影響[12]。Yield值為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)實(shí)際光化學(xué)量子效率，即實(shí)際光合效率，它反映PSⅡ反應(yīng)中心在有部分關(guān)閉情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率，細(xì)胞不經(jīng)過暗適應(yīng)在光下直接測得：

Yield=(Fm′-F)/ F′

其中，F(xiàn)′—光下最大熒光，光適應(yīng)下全部PSⅡ中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度

F—實(shí)際熒光產(chǎn)量，儀器測定時(shí)F值為打開飽和脈沖前的熒光

經(jīng)暗適應(yīng)后測得的Yield為PSⅡ最大光合效率：

Yield=(Fm-F0)/Fm

其中，F(xiàn)m—最大熒光，已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PSⅡ中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度

F0—最小熒光或初始熒光，已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PSⅡ中心都開放時(shí)的熒光強(qiáng)度

各參數(shù)由水樣熒光儀(WATER-PAM,Walz,Germany)測定[9]。為減小誤差，測定時(shí)間均在9點(diǎn)鐘左右，于室溫下暗適應(yīng)5 min后測定F0及Fm，計(jì)算得出Yield值。

2 結(jié)果與討論

2.1 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻生物量及活性的影響

A、B組銅綠微囊藻生物量如圖2所示。培養(yǎng)前12 d，A、B組藻細(xì)胞生物量均呈對(duì)數(shù)增長，之后緩慢增長，數(shù)量級(jí)不變。達(dá)到最大值后，由于營養(yǎng)鹽的限制，藻生長受到抑制，生物量開始下降。幾乎在整個(gè)生長周期中，A組銅綠微囊藻生物量均大于B組。這與許秋瑾等的研究結(jié)果一致[3]，是因?yàn)锽組四尾柵藻與銅綠微囊藻競爭營養(yǎng)鹽及生長空間，抑制了藻的大量增殖。A組生物量約在第38 d達(dá)到最大值，B組提前8 d左右達(dá)到最大值。

A、B組藻的光合作用活性如圖3所示。利用Water-PAM測定了兩組藻yield值，其中B組為銅綠微囊藻與四尾柵藻混合藻液的yield值。yield值是PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映了植物對(duì)光量子的最大利用潛能，非脅迫條件下該參數(shù)的變化極小，不受物種和生長條件的影響，脅迫條件下該參數(shù)明顯下降，是用來研究植物受到脅迫對(duì)光合作用影響的重要指標(biāo)[13,14]。由圖可見，培養(yǎng)前期兩組藻yield值不斷增大，第12 d達(dá)到最大。結(jié)合生物量數(shù)據(jù)來看，前12 d生物量呈對(duì)數(shù)增加，即對(duì)數(shù)期藻光合作用活性較強(qiáng)，藻生長潛能大。隨后yield值開始逐漸下降，生物量呈穩(wěn)定增加，數(shù)量級(jí)達(dá)到最大，不再增加。從開始培養(yǎng)至測量結(jié)束，B組yield值均高于A組，前期二者差距較小，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，差距也在增大。58 d內(nèi)，平均高出0.037。分別培養(yǎng)藍(lán)藻和綠藻時(shí)，藍(lán)藻的yield值一般較低，符合藍(lán)藻的生理特點(diǎn)，綠藻則較高[14]。本實(shí)驗(yàn)中B組yield值始終高于A組，就是因?yàn)锽組中存在綠藻。目前無法分開測定混合藻中銅綠微囊藻的光合作用活性。關(guān)于光合作用活性的研究多集中在環(huán)境影響因子、營養(yǎng)鹽限制等方面，種間競爭對(duì)光合作用活性的研究幾乎還是空白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，藻類生長過程中，光合作用活性與生物量之間存在一定的相關(guān)性，活性大，藻生長迅速，活性小，則生物量增加緩慢，數(shù)量級(jí)不變。監(jiān)測自然水體中藻類光合作用活性，對(duì)藍(lán)藻水華有預(yù)警作用，值得更加系統(tǒng)深入的研究。

圖2 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻生物量的影響

圖3 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻光合活性的影響

2.2 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻胞外毒素MC-LR的影響

A、B兩組藻液的細(xì)胞外MC-LR毒素濃度如圖4所示。A組藻液胞外MC-LR毒素始終處在較低水平，總體呈緩慢上升趨勢。因?yàn)榇舜螌?shí)驗(yàn)，營養(yǎng)鹽較豐富，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中，藻生長尚未達(dá)到衰亡期，細(xì)胞沒有開始大量死亡，釋放毒素較緩慢。而B組培養(yǎng)38 d后，胞外毒素濃度上升加快，說明此時(shí)藻已開始大量死亡。由圖可見，B組毒素濃度始終高于A組，培養(yǎng)后期B組上升速度加快，導(dǎo)致兩者差距越來越大，約第55 d達(dá)到最大值，此時(shí)B組胞外毒素比A組高606.7 μg/L。由此得出，當(dāng)起始濃度相同時(shí)，銅綠微囊藻單種培養(yǎng)比與四尾柵藻共培養(yǎng)釋放出更少的毒素MC-LR，這是由于四尾柵藻的存在，增加了銅綠微囊藻的生存壓力，釋放出更多的毒素，從而在競爭中占據(jù)優(yōu)勢。同時(shí)四尾柵藻也會(huì)分泌某些物質(zhì)抑制銅綠微囊藻的生長。有研究表明某些真核藻分泌的化感物質(zhì)可有效抑制銅綠微囊藻的生長和光合作用，具體影響有待更深入的研究。一般認(rèn)為微囊藻毒素為細(xì)胞內(nèi)毒素，在細(xì)胞內(nèi)合成，細(xì)胞死亡破裂后釋放到環(huán)境中。但是已有研究發(fā)現(xiàn)藻類在死亡之前也會(huì)向水體中釋放毒素，相關(guān)研究報(bào)道還不多，尚無明確結(jié)論。

圖4 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻胞外毒素MC-LR的影響

2.3 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)毒素MC-LR的影響

A、B 兩組藻整個(gè)生長過程中細(xì)胞內(nèi)毒素MC-LR濃度水平見圖5。其中A組總體呈上升趨勢，38 d達(dá)到最大值78.53 μg/L，隨后開始下降。B組胞內(nèi)MC-LR濃度也始終高于A組，最大值出現(xiàn)在第46 d，為334.35 μg/L。后期與A組距離逐漸拉大。

關(guān)于微囊藻毒素產(chǎn)生機(jī)理的研究是目前的熱點(diǎn)，有很多假設(shè)，但還無令人滿意的結(jié)果。有兩種可以考慮的可能性，一是遺傳差異即微囊藻有毒株和無毒株的遺傳結(jié)構(gòu)不同，另一種是環(huán)境因子影響或改變毒性[15]。本文研究表明，存在競爭時(shí)，銅綠微囊藻產(chǎn)毒會(huì)發(fā)生變化。以往已有研究表明，混合培養(yǎng)比單種培養(yǎng)產(chǎn)生更多的毒素[3]。本研究結(jié)果與此一致，A組生物量較B組大，但細(xì)胞內(nèi)外毒素MC-LR均低于B組。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)毒素水平上升。達(dá)到最大值后逐漸下降。日本學(xué)者Watanabe等人的研究表明，銅綠微囊藻停止生長后，在一段時(shí)間內(nèi)存在于固形物(包括藻和其他微生物)中的藻毒素含量與存在于水體中的藻毒素有很好的消長關(guān)系[16]。直至細(xì)胞全部死亡后，固形物中的毒素為零而水體中毒素達(dá)到最大，隨后開始被色素、光、微生物等降解，濃度開始下降。本次實(shí)驗(yàn)中A、B兩組藻均遵循這個(gè)規(guī)律。參考細(xì)胞生物量數(shù)據(jù)，本研究還發(fā)現(xiàn)，A組銅綠微囊藻個(gè)數(shù)總是比B組多，由此再結(jié)合細(xì)胞內(nèi)、外毒素MC-LR濃度可初步推斷，在四尾柵藻存在的情況下，每個(gè)銅綠微囊藻細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的毒素，且釋放出比單種培養(yǎng)更多的毒素到水體中。關(guān)于單個(gè)藻細(xì)胞產(chǎn)毒量的研究報(bào)道還不多，有待進(jìn)一步更精確的研究。

圖5 四尾柵藻對(duì)銅綠微囊藻胞內(nèi)毒素MC-LR的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)初步得出以下結(jié)論，銅綠微囊藻與四尾柵藻共培養(yǎng)時(shí)，生長受到一定的限制，最大生物量提前，單個(gè)銅綠微囊藻細(xì)胞比純種培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生更多的毒素。Yield值上升時(shí)，生物量呈對(duì)數(shù)增加，藻生長潛能大，暴發(fā)藍(lán)藻水華可能性大。Yield值達(dá)到最大，則生物量數(shù)量級(jí)也達(dá)到最大，不再增加。通過在線監(jiān)測藻類熒光，可使預(yù)警藍(lán)藻水華成為可能。實(shí)驗(yàn)初步研究了實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，關(guān)于機(jī)理還需更加深入的研究。共培養(yǎng)時(shí)，不僅生物量、毒素產(chǎn)生與釋放、光合作用活性等發(fā)生了變化，藻細(xì)胞尺寸大小的變化也同樣反應(yīng)了藻體特征參數(shù)的改變，而關(guān)于這方面的研究報(bào)道還很少，有待完善。

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