石斑魚屬魚類線粒體基因組序列特征及系統(tǒng)發(fā)育信息評估

黃小林， 呂國敏， 劉付永忠， 李 濤， 蔡云川， 馬志洲， 黃 忠

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源環(huán)境重點野外科學(xué)觀測試驗站，廣州 510300；2. 廣東省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,廣州 510222)

石斑魚是石斑魚屬(Epinephelus)魚類的統(tǒng)稱，在分類學(xué)上隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)。石斑魚的種類較多，全世界已記錄有100多種，其中，中國有40多種。石斑魚廣泛分布于熱帶至溫帶海域，是珊瑚礁中的重要捕食者，在海洋生態(tài)中占據(jù)著重要地位。該屬魚類多為名貴的食用魚，部分已成為重要的養(yǎng)殖對象，具有巨大的市場潛力。近年來，由于人類活動的影響：掠奪性開發(fā)、過度捕撈、海洋環(huán)境的污染和破壞、養(yǎng)殖群體的近親繁殖、外來種侵入等，魚類資源日益衰退[1-3]，而石斑魚個體發(fā)育中存在先雌后雄的性轉(zhuǎn)變過程，雄性親魚均高齡化(一般6齡以上)[4]，致使其自然資源的減少更加嚴(yán)重，部分種類已被世界自然保護聯(lián)盟(The World Conservation Union，簡稱IUCN)收錄到《瀕危物種紅皮書》(IUCN Red List )中，赤點石斑魚(Epinephelusakaara)等被列為瀕危物種[5]。

動物線粒體DNA是核外的遺傳物質(zhì)，具有母系遺傳、序列簡單、進(jìn)化速率快等特點，在進(jìn)化遺傳學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。線粒體全基因組序列與單個基因標(biāo)記相比，前者所包含的信息量更大，能反映出物種在基因組水平的遺傳特征，如基因的組成、排布等[6-9]。目前，在GenBank中已登錄有6種石斑魚線粒體基因組序列。本文在6條石斑魚線粒體基因組研究的基礎(chǔ)上，全面分析石斑魚線粒體基因組的基本結(jié)構(gòu)特征和變異位點，檢測蛋白質(zhì)編碼基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力，評估不同基因在石斑魚系統(tǒng)發(fā)育分析中的適用性。本研究旨在為石斑魚生物多樣性保護及其生物資源合理利用等方面提供遺傳信息，并為尋找合適的分子標(biāo)記提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因組全序列的獲取

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索并下載6條石斑魚屬魚類線粒體基因組全序列及一條相近屬(鰓棘鱸屬)豹紋鰓棘鱸[3](Plectropomusleopardus)的線粒體基因組全序列(作為外類群構(gòu)建分子系統(tǒng)樹)，其種名及序列的GenBank登錄號與相關(guān)信息詳見表1。

表1 6種石斑魚屬魚類線粒體基因組的基本信息

1.2 基因組結(jié)構(gòu)和堿基差異性分析

在Genbank中檢索統(tǒng)計每個物種基因組序列的長度、結(jié)構(gòu)和基因排布；用MEGA 4. 0[10]中的Clustal W程序進(jìn)行比對，人工去除末端難于排列的區(qū)域，之后用Mega 4.0和DnaSP 5.10[11]統(tǒng)計分析每個基因的變異率和堿基含量等信息。

1.3 非同義替換率( Ka)和同義替換率(Ks)分析

進(jìn)化速率是受穩(wěn)定性(負(fù))選擇、突變和定向(正)選擇控制的[6]。為檢驗石斑魚線粒體基因組在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力，用DnaSP 5.10對蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行基于Ka-Ks的Tajima’s D檢驗(Tajima’s D test)，之后用 McDonald-Kreitman test檢驗13個蛋白質(zhì)編碼基因的非同義替換率(Ka)與同義替換率(Ks)，計算得出每個蛋白質(zhì)編碼基因非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)的比值(Ka /Ks)。

1.4 不同基因分析石斑魚屬魚類系統(tǒng)進(jìn)化的能力評估

構(gòu)建分子系統(tǒng)樹的方法主要有距離矩陣法、最大簡約法及最大似然法三類。其中，距離矩陣法以結(jié)構(gòu)簡單、具有良好的理論基礎(chǔ)等特點最為廣泛。本文所采用的構(gòu)樹方法——鄰接法(Neighbor-Joining)是最常見的距離矩陣法之一[12]。

使用Mega 4.0中的鄰接法采用Kimura2-Parameter模式構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，分支的置信度采用重復(fù)抽樣分析法(Bootstrap=1000)。參照王中鐸等[13]的方法，評估基因組不同區(qū)域序列對石斑魚屬魚類系統(tǒng)進(jìn)化分析的適用性，該方法主要依據(jù)構(gòu)建NJ樹過程中Bootstrap獲取的置信度高低判斷系統(tǒng)樹的可靠性，計算得到單一序列構(gòu)建系統(tǒng)樹的置信度和以及堿基信息量(置信度和/序列長度)，并以13個蛋白質(zhì)編碼基因合并序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹為標(biāo)準(zhǔn)樹，比較分析線粒體基因組不同區(qū)域在系統(tǒng)進(jìn)化分析中的適用性，除構(gòu)建13個蛋白質(zhì)編碼基因的單一序列和合并序列的分子系統(tǒng)樹外，還利用mtDNA基因組序列(不含D-loop區(qū))、12S rRNA、16S rRNA構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果

2.1 石斑魚線粒體基因組的基本特征

6種石斑魚的線粒體基因組全長在16418bp(斜帶石斑魚)至16795bp (赤點石斑魚)之間(表1)，基因組結(jié)構(gòu)和排列順序一致(圖1)，均由37個基因(包括13個蛋白質(zhì)編碼基因、2個rRNA基因和22個tRNA基因)和一段控制區(qū)序列(D-loop)組成，基因排列緊湊，無內(nèi)含子。

線粒體全序列在堿基組成上均出現(xiàn)明顯的反G偏倚，G+C含量低于A+T含量。線粒體全序列(不含控制區(qū)序列)及13個蛋白質(zhì)編碼基因、2個核糖體RNA基因的差異位點分析詳見表2，在15個主編碼基因中，12S rRNA和16S rRNA基因最為保守，差異位點比例分別為13.6%和13.5%，其次為COX2基因和ND4L基因,差異位點比例分別為20.3%和23. 9%，差異位點比例最高的是ND6基因，高達(dá)33.9%。

圖1 石斑魚線粒體基因組的基因排列

表2 石斑魚屬魚類線粒體基因組及不同區(qū)域的序列長度、變異位點數(shù)(%)、G+C含量(%)、置信度和(N)及評價

注：表中VG(very good)、G(good)、M(middle)、P(poor)。

2.2 Ka/Ks分析及選擇檢驗

計算得到線粒體13個蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks[14]比值見圖2，所有13個蛋白質(zhì)編碼基因Ka/Ks均遠(yuǎn)小于1(0.079～0.448)，說明這13個蛋白質(zhì)編碼基因在進(jìn)化過程中均受到了強烈的凈化選擇作用，Tajima’s D檢驗[15]結(jié)果同樣表明石斑魚屬魚類線粒體編碼基因受到凈化選擇的作用(Tajima’s D=-0.8097～-0.05968 P>0.10)。在受到凈化選擇壓力的所有13個基因中，ATP8的Ka/Ks最大(0.448)，表明該基因進(jìn)化中受到的凈化選擇壓力最小，之后是ND6(Ka/Ks= 0.333)。相反，Cox3和ND3基因的Ka/Ks最小(分別是0.096和0.103)，表明這兩個基因在進(jìn)化中受到的凈化選擇壓力最大。

圖2 石斑魚屬魚類線粒體基因組13個蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/ Ks分析

2.3 線粒體基因組不同區(qū)域的分子系統(tǒng)樹

以同科異屬的豹紋鰓棘鱸(P.leopardus)作為外群，構(gòu)建了基于6種石斑魚(表1) 線粒體基因組全序列、13種蛋白質(zhì)編碼基因單一序列及合并序列的分子系統(tǒng)樹(NJ樹)。

圖3 線粒體DNA基因組全序列的 NJ 樹

圖4 蛋白編碼基因拼接序列的 NJ 樹

線粒體基因組及13種蛋白質(zhì)編碼基因合并序列的NJ樹(圖3和圖4)，由圖可見，13個蛋白質(zhì)編碼基因拼接序列所構(gòu)建的NJ樹除置信度和(N=390)略高于線粒體基因組全序列外，兩者聚類結(jié)構(gòu)完全一致。同科異屬的豹紋鰓棘鱸作為外類群位于樹的根部。本文中6種石斑魚分子系統(tǒng)樹結(jié)構(gòu)：褐帶石斑魚與云紋石斑魚最先聚成一支，再與斜帶石斑魚和鞍帶石斑魚聚成的一支形成姐妹支，之后再依次與七帶石斑魚和赤點石斑魚聚類。從分子系統(tǒng)樹中可以看出，褐帶石斑魚與云紋石斑魚的親緣關(guān)系較近，斜帶石斑魚和鞍帶石斑魚親緣關(guān)系較近，而赤點石斑魚和七帶石斑魚是這6種石斑魚中親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種。

基于單一蛋白質(zhì)編碼基因(Cytb、ND2、COX3等)全序列建立的NJ樹見圖5、圖6和圖7(其余基因的系統(tǒng)樹未列出)，相比13個基因拼接序列構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)樹(圖4)，Cytb和ND2基因的系統(tǒng)樹物種聚類關(guān)系一致，另外一致的還有ND5、COX2、16SrRNA基因，而COX3及其余基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹與標(biāo)準(zhǔn)樹的物種聚類關(guān)系存在差異。

圖5 基于Cytb基因的 NJ 樹

圖6 基于ND2基因的 NJ 樹

圖7 基于COX3基因的 NJ 樹

2.4 線粒體基因組不同區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育信息評價

線粒體基因組全序列、13個蛋白質(zhì)編碼基因拼接序列及單基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹經(jīng)1000次Bootstraps檢驗獲取的置信度和及每個堿基的平均信息量如表2所示。置信度和最高的是13個蛋白質(zhì)編碼序列合并序列(N=390)，明顯高于單基因序列，但其單堿基信息量(N/L=0.03)顯著低于所有單基因序列。13種單基因序列中，置信度和最高的是COX3基因(N=355)，其次是Cytb基因(N= 345)和ND2基因(N= 340)，而單堿基信息量最大的是ATP8基因(N/L = 1.31)。COX3基因雖然有著單基因序列中最高的置信度和(N= 355)，但基于其構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(圖7)與標(biāo)準(zhǔn)樹(圖4) 結(jié)構(gòu)不一致，故而不能作為石斑魚屬系統(tǒng)進(jìn)化分析中的理想分子標(biāo)記。而對于ND3、ND4L、ND6等基因，雖然單堿基的信息量較大，但是由于其系統(tǒng)樹的置信度和低，因此也不能作為石斑魚屬系統(tǒng)進(jìn)化分析中的理想分子標(biāo)記。在種群遺傳的研究中，分子標(biāo)記的選擇是至關(guān)重要的。綜上所述，對于石斑魚屬內(nèi)不同種間的系統(tǒng)發(fā)育分析，線粒體基因組不同區(qū)域的適用情況為: 最好的是Cytb和ND2基因，其次是ATP6和12S rRNA基因，ND4和COX2基因較差，其余基因表現(xiàn)中等。

3 討論

石斑魚屬魚類線粒體基因組結(jié)構(gòu)同大多數(shù)脊椎動物一樣[16]，包含13個蛋白質(zhì)編碼基因，2個rRNA基因，22個tRNA基因和1個非編碼控制區(qū)。

非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)的比值(Ka/Ks)常用來檢驗蛋白質(zhì)編碼基因所受選擇壓力。若Ka/Ks>1，即分析序列中非同義替換多于同義替換，表明該基因受到陽性選擇(適應(yīng)性選擇)；如果Ka/Ks=1，則說明該基因處于中性進(jìn)化；而當(dāng)Ka/Ks<1時，則表明該基因受到負(fù)選擇(純化選擇)[6,9]。本文研究的石斑魚屬魚類線粒體基因組中，所有13個蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks(圖2)均遠(yuǎn)小于1，都顯示出較強的凈化選擇作用。田美等[17]對短尾派(Brachyura)線粒體基因組，Shen等[18]對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)及Halocaridinarubra的線粒體基因組，Wu等[19]對金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、S.altishoulderus、巖原鯉(Procyprisrabaudi)及鯉(Cyprinuscarpio)的線粒體基因組等研究均發(fā)現(xiàn)線粒體的13個蛋白質(zhì)編碼基因均受到不同強度的凈化選擇作用。而田美等[23]在研究海膽綱粒體基因組時發(fā)現(xiàn)ATP8基因(Ka/Ks=1.373>0)存在陽性選擇(適應(yīng)性選擇)，這在海洋無脊椎動物線粒體基因組中為首次報道。另外張麗麗等[9]對鳀科魚類線粒體全基因組研究時也發(fā)現(xiàn)ND6基因(Ka/Ks=1.139>0)存在陽性選擇(適應(yīng)性選擇)。在該研究中，同樣發(fā)現(xiàn)石斑魚屬魚類線粒體基因組中ATP8和ND6兩個基因的Ka/Ks比值是最高的(分別為0.448和0.333)。

本文中石斑魚屬線粒體基因組序列(不含控制區(qū))構(gòu)建的系統(tǒng)樹的置信度和比蛋白質(zhì)編碼序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹的置信度和低，這與張麗麗等[9]的結(jié)果相一致，其認(rèn)為這可能是由于線粒體基因組序列中存在一些具有較差信息的基因，在構(gòu)建分子系統(tǒng)樹的過程中形成噪音，從而影響分子系統(tǒng)樹的準(zhǔn)確性。

表3 mtDNA蛋白編碼基因適用性

注：表中VG(very good)、G(good)、M(middle)、P(poor)。

線粒體基因組中不同基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力強弱不同，導(dǎo)致其進(jìn)化速率也有差異，因而不同基因序列所包含的系統(tǒng)發(fā)育信息也不盡相同[14]。Zardoya R等[20]、陳姝君等[21]、郭昱嵩等[22]、王中鐸等[13]及張麗麗等[9]分別基于脊椎動物、硬骨魚類、鱸形目、鳀科以及笛鯛屬等不同分類階元評估線粒體蛋白質(zhì)編碼基因在系統(tǒng)發(fā)育分析時的信息量(表3)。與前人研究結(jié)果相比，本文的研究結(jié)果總體上一致，但在某些基因上也存在差異，如前人研究中均認(rèn)為適用性好或中等的COX2和ND4基因在本研究中被評估為差，作者認(rèn)為這是由于在評估一個基因的適用性時沒有一個統(tǒng)一的參數(shù)，都只是相對自己研究物種的各個基因做出的評價，因此在做橫向比較時缺乏一個標(biāo)準(zhǔn)可供參照。另外，本文的研究結(jié)果與王中鐸等[12]研究的笛鯛屬比較接近，作者認(rèn)為這是由于這兩個研究的對象都是同一階元(屬)的緣故，這說明在系統(tǒng)發(fā)育分析時不同階元應(yīng)選擇不同的基因作為分子標(biāo)記，本文通過石斑魚屬與同階元及不同階元的比較揭示了線粒體基因組中不同基因進(jìn)化的規(guī)律，對于實際應(yīng)用中根據(jù)分類階元選擇合適基因作為分子標(biāo)記將有一定指導(dǎo)意義。

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