激活LXR降低腦Aβ與膽固醇及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系

石 蕓， 姚 敏， 侯連國， 李 靜， 楊 原， 姜玲玲

(1．河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室， 石家莊 050017；2．河北省人民醫(yī)院， 石家莊 050017)

β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)生成增多和在腦內(nèi)的沉積是阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，探究Aβ生成的影響因素，對(duì)防治AD有著十分重要的意義。

研究表明，Aβ的產(chǎn)生和沉積與腦膽固醇的代謝有密切的關(guān)系。由于血腦屏障的存在，腦細(xì)胞內(nèi)膽固醇的水平只與其原位合成量和轉(zhuǎn)出量有關(guān)[1]。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA redactase，HMG-CoAR)是膽固醇合成的限速酶，其活性決定了腦膽固醇的合成量。用他汀類藥物特異性地抑制HMG-CoAR的活性，降低膽固醇的合成，可明顯降低神經(jīng)細(xì)胞的Aβ水平[2]。肝X受體(liver X receptor，LXR)是一種核受體，與其相應(yīng)的配體結(jié)合活化后，可上調(diào)靶基因ATP盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇向細(xì)胞外載脂蛋白的轉(zhuǎn)移，降低胞內(nèi)膽固醇水平[3]。用LXR的激活配體處理轉(zhuǎn)基因的AD模型小鼠和小鼠海馬細(xì)胞后，ABCA1被明顯誘導(dǎo)表達(dá)，腦膽固醇降低，有效地降低了Aβ的水平[4， 5]。已知，正常鼠與轉(zhuǎn)基因鼠有著不同的基因背景，LXR的激活配體對(duì)正常鼠是否有同樣的效果？另外，腦中膽固醇是經(jīng)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)膽固醇-24S-羥化酶(cholesterol-24S-hydroxylase，CYP46)轉(zhuǎn)化為24S-羥基膽固醇后通過血腦屏障出腦的[6， 7]。而細(xì)胞膽固醇通過胞內(nèi)的ABCA1、ABCG1轉(zhuǎn)出細(xì)胞外，呈遞給apoE等載脂蛋白后[8]，只在腦內(nèi)轉(zhuǎn)移[9， 10]。因此，上述LXR被激活上調(diào)ABCA1時(shí)，腦總膽固醇的降低是否與CYP46的轉(zhuǎn)錄上調(diào)有關(guān)？未見報(bào)道。

為此，本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用人工合成配體TO901317激活LXR，觀察腦Aβ和膽固醇水平以及CYP46 mRNA表達(dá)的變化，探討LXR激活對(duì)腦膽固醇和Aβ水平的影響，為尋找預(yù)防AD的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

8～10周齡成年雄性C57BL/6J小鼠20只，體重20～25 g，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

TO901317購自cayman公司；Trizol購自Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；Taq DNA聚合酶購自鼎國生物公司；總膽固醇測(cè)定試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司；Aβ放免測(cè)定試劑盒購自北京301放免研究所；其它試劑為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。所用引物由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 引物序列

1.3 主要方法

1.3.1 動(dòng)物分組及取材

將小鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(Con組，10只)和激動(dòng)劑組(TO組，10只)。將LXR激動(dòng)劑TO901317溶于二甲基亞砜中(25 mg/mL)，用1%羧甲基纖維素按體積比1∶150稀釋后，予以TO組鼠灌胃(20 mg/kg/d)。Con組鼠給予不含TO901317的其它組分相同的上述液體灌胃。小鼠連續(xù)灌胃7 d后，禁食不禁水一晚，10%水和氯醛麻醉，斷頭處死，取腦組織于液氮冷凍后，-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 腦組織Aβ的測(cè)定

[11]的方法，稱取80 mg左右的腦組織，加入1200 uL 70%甲酸，冰浴勻漿，勻漿液在4℃，12000 r/min離心30 min，取上清液400 uL，加入1 mol/L Tris-HCl 3.6 mL (pH值8.0)稀釋10倍，充分混勻，4℃，12000 r/min離心30 min，去除沉淀，用于Aβ的測(cè)定。用試劑盒測(cè)定其Aβ含量后，用改良Lowry法定量總蛋白，算出每毫克總蛋白內(nèi)所含的Aβ的量，用pg/mg表示。

1.3.3 腦組織中膽固醇含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取腦組織，按1 g組織加29 mL氯仿/甲醇(2∶1 V/V)溶液的比例，冰浴勻漿，勻漿液3000 r/min離心5 min，留取上清液；沉淀中再加氯仿/甲醇(2∶1 V/V)溶液(第一次用量的2/3量)，勻漿，3000 r/min離心5 min后留取上清，合并兩次留取的上清液。取適量上清液，按2 mL上清加入1 mL含2% Triton X-100的氯仿溶液的比例混勻，60℃水浴蒸干，將蒸干樣品復(fù)溶于三蒸水中，用于膽固醇的測(cè)定。按試劑盒說明書測(cè)定膽固醇含量后，計(jì)算出每克腦組織中膽固醇的含量，用mg/g表示。

1.3.4 RT-PCR

采用Trizol法分離純化腦組織的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR，總反應(yīng)體積25 μL，其中10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，Taq DNA聚合酶2 U，cDNA 1.5 μg，引物 0.5 μmol/L。擴(kuò)增條件為：95°C 預(yù)變性2 min，94°C變性1 min，55°C 45 s (for β-actin)，or 62°C 45 s(for ABCA1)，or 59°C 45 s(for CYP46)，72°C 60 s，30個(gè)循環(huán)，72°C 延伸5 min。然后，取RT-PCR產(chǎn)物8 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展公司)分析各目的基因與β-actin基因條帶吸光度的比值，以此作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦LXR下游基因ABCA1 mRNA表達(dá)的變化

激動(dòng)劑組(TO)ABCA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組(Con)明顯增高(P<0.01)，見圖1，表明LXR被激動(dòng)劑激活。

圖1 RT-PCR檢測(cè)激動(dòng)劑組和對(duì)照組大鼠腦中LXR下游基因ABCA1 mRNA的表達(dá)水平

2.2 小鼠腦Aβ含量的變化

激動(dòng)劑組(TO)Aβ的含量較對(duì)照組(Con)有所降低(P<0.05)，見圖2，提示激活LXR有效地降低了小鼠腦Aβ的含量。

2.3 小鼠腦總膽固醇含量的變化

激動(dòng)劑組(TO)的總膽固醇含量較對(duì)照組(Con)降低(P<0.05)，且腦總膽固醇含量與Aβ的含量呈正相關(guān)(r=0.57，P<0.05)，見圖3，表明激活LXR引起的Aβ含量減少與腦膽固醇的降低有關(guān)。

圖2 放免法檢測(cè)激動(dòng)劑組和對(duì)照組大鼠腦中Aβ的水平

圖3 A. 酶法檢測(cè)激動(dòng)劑組和對(duì)照組大鼠腦中膽固醇的含量；B. 大鼠腦膽固醇和Aβ含量的相關(guān)性分析

2.4 小鼠腦膽固醇-24S-羥化酶CYP46 mRNA的表達(dá)變化

激動(dòng)劑組(TO)CYP46 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組(Con)明顯增高(P<0.01)，見圖4，CYP46 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與腦膽固醇的含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.87，P<0.01)。表明LXR的激活伴隨CYP46 mRNA表達(dá)增加，后者與膽固醇的降低有關(guān)。

圖4 A. RT-PCR檢測(cè)激動(dòng)劑組和對(duì)照組大鼠腦中CYP46 mRNA的表達(dá)水平；B. 大鼠腦膽固醇和CYP46 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

Aβ由β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，AβPP)經(jīng)β-，γ-位點(diǎn)的AβPP內(nèi)切酶催化裂解產(chǎn)生。AβPP的β-位點(diǎn)以及β-位點(diǎn)的內(nèi)切酶位于細(xì)胞膜的脂筏中[12]。膽固醇是細(xì)胞膜、神經(jīng)髓鞘的重要組成成分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性、流動(dòng)性以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。減少細(xì)胞的膽固醇可以提高膜流動(dòng)性，從而減少β-位點(diǎn)內(nèi)切酶的活性，有效地減少Aβ的生成和聚集沉積量[13]。激活轉(zhuǎn)基因的AD模型小鼠LXR后，腦膽固醇水平降低，腦Aβ降低，緩解了AD的病理過程[14]。與上述報(bào)道一致，本實(shí)驗(yàn)中，我們用TO901317激活正常小鼠LXR后，腦內(nèi)膽固醇與Aβ也被明顯降低。

由于膽固醇不能自由通過血腦屏障，腦組織的膽固醇幾乎都是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞自身合成[1]。腦內(nèi)64%以上的膽固醇也需在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)經(jīng)CYP46將其轉(zhuǎn)化為24S-羥基膽固醇后通過血腦屏障出腦[6]。而腦細(xì)胞的膽固醇通過胞內(nèi)的ABCA1、ABCG1轉(zhuǎn)出細(xì)胞外，呈遞給apoE等載脂蛋白，只在腦內(nèi)的轉(zhuǎn)移[8-10]，或轉(zhuǎn)到神經(jīng)元細(xì)胞被羥化成24S-羥基膽固醇后通過血腦屏障，或是轉(zhuǎn)到需要膽固醇的部位[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TO901317激活LXR后，不僅LXR的靶基因ABCA1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，CYP46的轉(zhuǎn)錄也同時(shí)明顯上調(diào)，并且CYP46 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與腦總膽固醇含量呈負(fù)相關(guān)。這表明，伴隨LXR激活所發(fā)生的腦膽固醇下降，與膽固醇經(jīng)ABCA1出胞，以及經(jīng)24S-羥膽固醇途徑出腦的機(jī)制同時(shí)被上調(diào)有關(guān)。證明，CYP46有可能在激活LXR降低腦膽固醇，降低Aβ的過程中發(fā)揮重要作用。

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