食品中沙門氏菌測(cè)定能力驗(yàn)證和關(guān)鍵控制點(diǎn)分析

宋 洋

（寧德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建寧德 352100）

0 引言

沙門氏菌（Salmonella） 是一種常見的、容易造成食源性疾病的細(xì)菌[1]。1885 年美國(guó)細(xì)菌學(xué)家D. E.Salmon 首次從豬腸道中分離出這種細(xì)菌而得名，目前發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌屬有腸道沙門氏菌和邦戈?duì)柹抽T氏菌2 種，大約有2 600 種血清型[2-3]。人食用沙門氏菌污染的食物，可能導(dǎo)致食物中毒，大多數(shù)表現(xiàn)為患上腹瀉等胃腸道疾病[4]。

為了防止沙門氏菌污染的食品流入市場(chǎng)，保障食品安全，我國(guó)禁止在散裝即食食品和預(yù)包裝食品中檢出沙門氏菌[5-6]，并制定《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》 （GB 4789.4—2016）[7]。機(jī)構(gòu)或企業(yè)對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)需求也不斷加強(qiáng)，為了不斷保障和提高沙門氏菌的檢測(cè)能力，可以選擇參加能力驗(yàn)證。能力驗(yàn)證是指利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力，實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由2 個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類似的物品進(jìn)行測(cè)量或檢測(cè)的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)[8]。參加能力驗(yàn)證，能提高或確保檢測(cè)方法的有效性，符合國(guó)際質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求[9]。該實(shí)驗(yàn)室希望通過參加“食品微生物（沙門氏菌） 的測(cè)定”能力驗(yàn)證，并通過分析檢測(cè)過程，提升對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)能力。

1 材料和方法

1.1 樣品

實(shí)驗(yàn)室參加華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司開展的“CTI-0422110131 食品微生物（沙門氏菌） 的測(cè)定”能力驗(yàn)證計(jì)劃后，收到該公司寄出的2 瓶真空西林瓶裝樣品。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水（BPW，批號(hào)：191023）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC，批號(hào)：201222）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB，批號(hào)：210223）、HE 瓊脂（HE，批號(hào)：210607）、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基（BS，批號(hào)：210125）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（批號(hào)：210603）、0.1%煌綠溶液（批號(hào)：211214）、碘液（批號(hào)：220104） 等，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；沙門氏菌生化鑒定盒（批號(hào)：5110419），廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD，批號(hào)：1090311），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；氯化鈉（NaCl，批號(hào)：20220514），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 儀器設(shè)備

HFsafe-1200 型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MLS-3751L-PC 型高壓蒸汽滅菌器，日本三洋電子科技有限公司產(chǎn)品；GNP-9270 型隔水氏恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；YP3002 型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司產(chǎn)品；HYCD-290 型醫(yī)用冷藏冷凍冰箱，青島海爾特種電器有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)前期準(zhǔn)備

（1） 樣品信息登記。將收到的樣品進(jìn)行完整度檢查并登記樣品信息，CTI-0422110131 食品微生物（沙門氏菌） 的測(cè)定能力驗(yàn)證樣品2 瓶，瓶身標(biāo)識(shí)分別為No.006 和No.107。將樣品置于-20 ℃保存，閱讀能力驗(yàn)證計(jì)劃作業(yè)指導(dǎo)書后開始試驗(yàn)。

（2） 培養(yǎng)基配制和滅菌。分別按照培養(yǎng)基和試劑瓶身標(biāo)識(shí)說明，配制225 mL BPW 培養(yǎng)基2 份，100 mL TTB 培養(yǎng)基1 份，10 mL SC 培養(yǎng)基2 份，150 mL BS 培養(yǎng)基1 份，150 mL XLD 培養(yǎng)基1 份，150 mL HE 培養(yǎng)基1 份，150 mL 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)基，按照121 ℃，15 min 條件進(jìn)行蒸汽滅菌，在生物安全柜內(nèi)將對(duì)應(yīng)量碘液和0.1%煌綠溶液加入TTB 后進(jìn)行分裝，每10 mL 裝入1 支試管。BS、XLD、HE、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基按每個(gè)平皿約20 mL 進(jìn)行倒平板。

（3） 無(wú)菌生理鹽水溶液。稱取1.35 g 氯化鈉（NaC）l 放入250 mL 錐形瓶中，加入150 mL 純化水，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl 溶液，按照121 ℃，15 min 條件進(jìn)行蒸汽滅菌后制得。

（4） 無(wú)菌瓶。準(zhǔn)備2 個(gè)250 mL 空的錐形瓶，按照121 ℃，15 min 條件進(jìn)行蒸汽滅菌備用。

1.4.2 樣品處理

在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。從冰箱取出的樣品No.006，回溫至室溫后，小心開啟西林瓶。按作業(yè)指導(dǎo)書要求，用60 mL 無(wú)菌生理鹽水對(duì)樣品進(jìn)行再水化，先加4 mL，待樣品溶解后吸入無(wú)菌瓶中，用剩余56 mL 反復(fù)清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液至無(wú)菌瓶，作為待測(cè)樣品原液，試驗(yàn)編號(hào)6。另一個(gè)樣品No.107 按上述步驟同樣操作，試驗(yàn)編號(hào)107。

1.4.3 預(yù)增菌和增菌

按照GB 4789.4—2016 方法開始檢驗(yàn)，無(wú)菌操作取25 mL 6 號(hào)樣品原液倒入裝有225 mL BPW 的瓶中，搖勻后，放入36.0 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h，輕搖后，移取1 mL 到TTB 內(nèi)，于42.0 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，同時(shí)移取1 mL 到SC 內(nèi)，于36.0 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。107 號(hào)樣品操作步驟相同。

1.4.4 分離

分別用接種環(huán)取SC 1 環(huán)，劃線接種于BS 平板、XLD 平板、HE 平板、沙門氏菌顯色平板各1 個(gè)，于36.0 ℃分別培養(yǎng)48 h（BS 平板） 或24 h（XLD 平板、HE 平板、沙門氏菌顯色平板），觀察菌落形態(tài)，與GB 4789.4—2016 中所述沙門氏菌屬菌落特征進(jìn)行比較，鑒別是否有符合的典型菌落，對(duì)TTB 重復(fù)上述步驟，得到表1 和圖1。

圖1 增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態(tài)直觀圖

表1 增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態(tài)和鑒別

增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態(tài)和鑒別見表1，增菌液中分離到的菌株在平板上的菌落形態(tài)直觀圖見圖1。

1.4.5 生化試驗(yàn)

按照沙門氏菌生化鑒定盒使用說明書，挑取6號(hào)樣品經(jīng)SC 增菌后分離到的菌株在BS 平板、XLD平板、沙門氏菌顯色平板上典型菌落各1 個(gè)，編為6-1，6-2，6-3。進(jìn)行三糖鐵瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)，待試驗(yàn)出結(jié)果后，根據(jù)說明書判斷可能的菌屬和種。從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑沙門氏菌屬菌落，按說明書要求進(jìn)行沙門氏菌屬生化試驗(yàn)：蛋白胨水（供靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（PH7.2）、氰化鉀試驗(yàn)，觀察現(xiàn)象。挑取107號(hào)樣品經(jīng)SC 和TTB 增菌后分離到的菌株在XLD 平板、HE 平板上疑似沙門氏菌特征菌落的淡紅色中心且邊緣呈白色菌落、墨綠色菌落和黃褐色菌落各1 個(gè)，編號(hào)107-1，107-2，107-3。重復(fù)6 號(hào)樣品操作步驟。

1.5 結(jié)果上報(bào)和反饋

按能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書要求，上傳試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)記錄。根據(jù)能力驗(yàn)證反饋結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和分析

6 號(hào)和107 號(hào)樣品經(jīng)過增菌后在選擇性平板上的菌落，按照沙門氏菌生化鑒定盒說明書步驟開展生化試驗(yàn)，說明107 號(hào)樣品未檢出沙門氏菌。挑取6 號(hào)樣品可疑沙門氏菌屬菌落進(jìn)行沙門氏菌屬生化反應(yīng)鑒別，說明6 號(hào)樣品中檢出沙門氏菌。

三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果和鑒別見表2，沙門氏菌屬生化反應(yīng)鑒別見表3。

表2 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果和鑒別

表3 沙門氏菌屬生化反應(yīng)鑒別

按作業(yè)指導(dǎo)書要求填寫2 個(gè)樣品中沙門氏菌的定性結(jié)果：No.006 為陽(yáng)性，No.107 為陰性，并上傳試驗(yàn)原始記錄。華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司對(duì)能力驗(yàn)證結(jié)果反饋為“滿意”，說明該實(shí)驗(yàn)室順利通過此次能力驗(yàn)證。

3 關(guān)鍵控制點(diǎn)分析

3.1 樣品接收和實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備

能力驗(yàn)證組織方在寄出能力驗(yàn)證樣品時(shí)會(huì)告知參與單位，參與單位在收到待測(cè)樣品后，要嚴(yán)格檢查待測(cè)樣品的完整度，確認(rèn)無(wú)破損。如果收到待測(cè)樣品和寄出樣品時(shí)間間隔超過7 d、裝有待測(cè)樣品容器破損、待測(cè)樣品碎成粉末，建議和寄出樣品人員方溝通，重新寄出一份樣品，避免因?yàn)檫\(yùn)輸原因?qū)е麓郎y(cè)樣品中微生物損耗或者染菌，降低通過率。收到樣品，詳細(xì)登記樣品信息后，若未立即開始試驗(yàn)，應(yīng)將樣品放入適宜貯存的環(huán)境中。準(zhǔn)備開展或用于能力驗(yàn)證的環(huán)境、儀器、培養(yǎng)基、試劑都應(yīng)是經(jīng)過檢定或檢測(cè)符合實(shí)驗(yàn)需求的。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基和試劑應(yīng)現(xiàn)配。試驗(yàn)前要熟悉能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書、GB 4789.4—2016 檢驗(yàn)方法、生化鑒定試劑盒或生化鑒定儀器的說明書等內(nèi)容。

3.2 試驗(yàn)過程

BPW 用于預(yù)增菌，作用是修復(fù)受損傷的沙門氏菌，GB 4789.4—2016 中對(duì)BPW 培養(yǎng)時(shí)間規(guī)定為8~18 h，跨度較大，并且桂國(guó)弘等人[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過BPW 增菌12 h 處理后的冷鮮雞微生物，沙門氏菌的檢出率最高，所以試驗(yàn)中對(duì)BPW 預(yù)增菌的時(shí)間要注意把握。GB 4789.4—2016 規(guī)定要同時(shí)用TTB 和SC進(jìn)行增菌，是因?yàn)橛谏抽T氏菌屬血清型較多，TTB和BS 增菌有互補(bǔ)效果，所以試驗(yàn)中不能僅用其中1種進(jìn)行增菌。GB 4789.4—2016 中要求選用的2 種選擇平板中至少1 種是BS 平板，可能是由于BS 平板選擇性較好。試驗(yàn)過程中接種分離也比較重要，能力驗(yàn)證中6 號(hào)樣品在部分選擇性平板中無(wú)菌落生長(zhǎng)，可能是由于接種環(huán)蘸取的增菌液比較少或者增菌液未搖勻。生化試驗(yàn)按GB 4789.4—2016 要求，可以選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，試驗(yàn)用的生化鑒定試劑盒，已經(jīng)過驗(yàn)收，符合試驗(yàn)需求。由于本次能力驗(yàn)證是定性試驗(yàn)，所以也未進(jìn)行沙門氏菌屬血清學(xué)鑒定、血清學(xué)分型試驗(yàn)。有條件的實(shí)驗(yàn)室可以利用如PCR 技術(shù)、LMAP 技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、基因芯片、基因測(cè)序、MALDI 飛行時(shí)間質(zhì)譜分析、快速檢測(cè)卡等檢測(cè)技術(shù)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，確保能力驗(yàn)證通過[11-13]。

3.3 結(jié)果處理

要按要求在規(guī)定時(shí)間內(nèi)上報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并上傳原始記錄。結(jié)果表示要符合要求，如本次試驗(yàn)要求上報(bào)的定性結(jié)果用“陽(yáng)性”或“陰性”表示，就不能用“+”“-”或“檢出”“未檢出”代替。

能力驗(yàn)證出現(xiàn)結(jié)果錯(cuò)誤的可能原因和處理方法見表4。

表4 能力驗(yàn)證出現(xiàn)結(jié)果錯(cuò)誤的可能原因和處理方法

4 結(jié)論

食品安全備受矚目，加強(qiáng)食品中致病菌的檢測(cè)重要性日益凸顯，提高檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品中致病菌檢測(cè)能力刻不容緩。實(shí)驗(yàn)室參與沙門氏菌能力驗(yàn)證作為機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)檢測(cè)能力的一種方法[14]，是一種重要的外部質(zhì)量保證手段，不僅考核實(shí)驗(yàn)操作者的能力，也是對(duì)實(shí)驗(yàn)室致病微生物檢測(cè)綜合能力的考核。通過參與能力驗(yàn)證，可以發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中包括實(shí)驗(yàn)操作、儀器設(shè)備、數(shù)據(jù)和結(jié)果處理等存在的問題，以及與同行間的差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)技術(shù)水平有一個(gè)直觀的認(rèn)識(shí)。但是，必須要注意的是單次能力驗(yàn)證的結(jié)果只代表某一個(gè)時(shí)刻或某段時(shí)間實(shí)驗(yàn)室對(duì)該項(xiàng)目的檢測(cè)能力，并不一定能完全體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的真實(shí)檢測(cè)能力[15]。定期開展沙門氏菌能力驗(yàn)證并分析能力驗(yàn)證中關(guān)鍵控制點(diǎn)，有助于提高實(shí)驗(yàn)室人員的檢驗(yàn)?zāi)芰Γ嵘龣C(jī)構(gòu)的檢測(cè)水平，強(qiáng)化對(duì)食品安全的保障能力。