N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大腸桿菌中的表達純化及其脫糖基化作用鑒定

閔偉勇,劉 麗,張 舟

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院,上海 200234)

0 引 言

N-糖酰胺酶F(PNGase F)主要是由腦膜炎膿桿菌等革蘭氏陰性菌分泌的一種酰胺水解酶,分子量為34.8 kDa,也存在于一些真核生物細胞內(nèi)[1-2].N-糖酰胺酶F能從糖蛋白完整切下N-寡糖鏈,并將蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化為天冬氨酸[2-4].由于N-糖酰胺酶F切斷的是天冬酰胺殘基的Cγ與Nδ的結(jié)合,因此又被稱為N-乙酰-β-D-天冬酰胺酶[5].

N-糖酰胺酶F具有廣泛的底物專一性,對所有類型的N-連接的糖蛋白都有作用[6-7].但是天冬酰胺殘基的氨基和羧基必須形成肽鍵的形式,并且糖鏈至少包含一個N,N′-二乙酰殼二塘核心(GlcNAcb1→4GlcNAc)[8-9].實際上,它廣泛的底物特異性是由于缺少了各種天冬酰胺多糖的外圍碳水化合物部分.N-糖酰胺酶F在糖蛋白的研究和分析中作為一種生物化學工具被廣泛應(yīng)用,包括寡糖類的研究以及糖蛋白的脫糖基化研究等[9].

腦膜炎膿桿菌的N-糖酰胺酶F基因的閱讀框中含有1 062個堿基,前120個堿基編碼的氨基酸為信號肽,因此表達的蛋白質(zhì)為314個氨基酸,分子量為34.8 kDa[9].從腦膜炎膿桿菌中提取N-糖酰胺酶F十分耗資和耗時,步驟繁瑣多級化,并且產(chǎn)率低,每升發(fā)酵液只能獲得0.1～0.5 mg N-糖酰胺酶F[10],而且腦膜炎膿桿菌為病源菌,不適合大規(guī)模發(fā)酵.這些因素極大的限制了N-糖酰胺酶F的制備和應(yīng)用.本研究中,將PNGase F基因連接到pET28a載體上,構(gòu)建了一個含有His-tag的重組表達載體.在大腸桿菌中經(jīng)過低溫誘導表達獲得大量高純度可溶性表達的N-糖酰胺酶F.

鈉離子依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(SoDium-coupleD Neutral Amino AciD Transporter,SNAT)屬于SLC38基因家族.根據(jù)各成員對轉(zhuǎn)運底物的特異性,SLC38 家族又分為System A 和System N 兩個亞族,其中SNAT1和SNAT2屬于System A,具有重要的生理功能,其功能紊亂可引起神經(jīng)退行性疾病[11-18].SNAT1和SNAT2被預測具有11個跨膜區(qū)域,其N端在細胞內(nèi),C端在細胞外,在第六和第七個跨膜區(qū)域之間的細胞膜外側(cè)的loop上含有兩個N-糖基化位點[13,19].通過Western-blot檢測SNAT1或SNAT2的表達和定位時,糖基化位點的存在使蛋白條帶模糊,并影響蛋白分子的遷移,這對SNAT1或SNAT2的結(jié)構(gòu)與功能的研究帶來了不便.

本研究在大腸桿菌中大量表達和純化N-糖酰胺酶F,檢測了其對膜蛋白SNAT1和SNAT2的去糖基化作用,證明了N-糖酰胺酶F的有效性和高效性,同時證實了SNAT1或SNAT2分子中糖基化位點的存在,并為SNAT1和SNAT2的結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了條件.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細胞株

質(zhì)粒pBK-CMV(Δ[1 098-1 300])-SNAT1-HA、pBK-CMV(Δ[1 098-1 300])-SNAT2-HA(以下簡稱pBK-CMVΔ-SNAT1-HA和pBK-CMVΔ-SNAT2-HA)、pET28a由本實驗室保存;PNGase F基因來自于同濟大學;大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自天根生化;大腸桿菌BL21由本實驗室保存;人胚胎腎細胞(HEK293T/17,ATCC number CRL 11268)購自中國科學院上海分院細胞庫.

1.1.2 工具酶和生化試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA連接酶、CIP(去磷酸化酶)、PNGase F購自美國NEB公司;2×Taq MasterMix購自天根生化;LipofectamineTM2000 Reagent購自Invitrogen公司;DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司;Cocktail 蛋白酶抑制劑購自Roche公司;PVDF膜購自Millipore公司;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自國藥集團化學試劑公司;Ni柱購自GE healthcare公司;Mouse Anti-c-HA Tag Monoclonal AntiboDy購自中科英沐公司;Goat Anti-Mouse IgG(H&L)-HRP ConjugateD SeconDary AntiboDy購自Sigma公司.本研究所用引物由上海生工生物工程有限公司合成,杰李測序公司完成測序.

1.2 方 法

1.2.1 PCR擴增N-糖酰胺酶F基因

以PNGase F基因為模板設(shè)計上下游引物,分別在上下游引物引入EcoR I和Xho I單酶切位點:

ForwarD primer: 5′ GTAGTTCCGGAATTCGCTCCGGCAGATAATACC 3′

Reverse primer: 5′ CAACCGCTCGAGTTAGTTTGTAACTACCGGAGC 3′

以PNGase F基因為模板利用上下游引物進行PCR擴增.產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收.

1.2.2 pET28a-PNGase F重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用EcoR I、Xho I限制性內(nèi)切酶對PNGaseF的PCR產(chǎn)物和pET28a進行雙酶切處理回收后,將載體大片段與目的片段以1∶3的摩爾比連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中.挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進行菌液PCR初步鑒定;提取質(zhì)粒DNA進行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定以及DNA測序鑒定.

1.2.3 N-糖酰胺酶F的誘導表達

將pET28a-PNGase F重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中(含卡那霉素30 μg/mL),270 r/min培養(yǎng)到OD=0.7,加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L),180 r/min 16 ℃振蕩誘導培養(yǎng)10 h.

1.2.4 N-糖酰胺酶F的提取與純化

誘導表達后的菌液4 500 r/min離心15 min,用10 mL懸浮緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,100 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA)懸浮菌體,加溶菌酶至30 μg/ml,并加入蛋白酶抑制劑,4 ℃混勻搖蕩30 min.用液氮反復凍融破碎細胞,4 ℃ 10 000 r/min離心30 min.取上清過2 mL Ni親和柱,用含咪唑濃度梯度的洗脫液(50 mmol/L、80 mmol/L、120 mmol/L、160 mmol/L、200 mmol/L及240 mmol/L咪唑)各5 mL洗脫柱子,接洗脫液.取全細胞破碎液、離心上清液、過柱流出液、洗滌液及洗脫液跑SDS-PAGE電泳.

1.2.5 SNAT1和SNAT2總蛋白的提取

將質(zhì)粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA或pBK-CMVΔ-SNAT2-HA瞬時轉(zhuǎn)染進HEK293T 細胞中培養(yǎng)36 h后,用冰預冷的 PBS(含0.1 mmol /L Ca2+,1 mmol /L Mg2+)洗滌,加冰預冷的RIPA 裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% TritonX-100、1% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS、cocktail蛋白酶抑制劑).收集細胞裂解液,于4 ℃,1 000 r /min離心15 min后取上清,記為總蛋白,并用BCA試劑盒測定蛋白濃度.

1.2.6 Western-blot檢測N-糖酰胺酶F的脫糖基化作用

在20 μg的總蛋白中加入糖蛋白變性緩沖液、10×G7緩沖液及10% NP-40,然后分別加入不同量純化的N-糖酰胺F,用1.5 μg商業(yè)化的PNGase F作為對照,37 ℃溫浴1.5 h.應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測N-糖酰胺酶F對SNAT1和SNAT2脫糖鏈的作用.鼠源抗HA的一抗( 1∶3 000),羊抗鼠IgG-HRP二抗( 1∶60 000).顯影完成后,用Stripping buffer洗膜30 min,用以上相同步驟檢測β-actin(一抗1∶1 000)或GAPDH(一抗1∶3 000)作對照.

2 結(jié) 果

2.1 pET28a-PNGase F重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以PNGase F質(zhì)粒為模板利用上下游引物進行PCR擴增,擴增出945 bp的 N-糖酰胺酶F基因.PCR產(chǎn)物回收后,將經(jīng)過相同雙酶切處理后的pET28a(5 341bp)與PNGaseF連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中.

挑取10個單菌落進行菌液PCR鑒定,結(jié)果顯示有3個陽性克隆(圖1A).取其中一個陽性克隆用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示945 bp和5 341 bp兩個片段(圖1B),證實目的片段已插入到載體大片段中.為確保重組質(zhì)粒的正確,無移碼突變等情況的出現(xiàn),對該克隆進行DNA測序,獲得序列正確的pET28a-PNGase F質(zhì)粒.

A:1～10:10個單菌落的菌液PCR結(jié)果;11:陰性對照;12:陽性對照;13:DL10 000 DNA 分子量標準;B:1:EcoR I/Xho I雙酶切pET28a-PNGase F;2:DL10 000 DNA 分子量標準圖1 pET28a-PNGase F克隆的菌液PCR及雙酶切檢測

2.2 N-糖酰胺酶F的表達與純化

將經(jīng)過測序鑒定正確的pET28a-PNGase F重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞.挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入IPTG,16 ℃低溫振蕩誘導表達.菌體經(jīng)過液氮反復凍融破碎離心后,上清過Ni親和層析柱純化,取各純化步驟的樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測,目的蛋白分子量約在35 kDa,圖2顯示了用120 mmol/L和160 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的結(jié)果.收集純度在95%以上的N-糖酰胺酶F(圖2泳道8-13的樣品),測得蛋白濃度為0.88 g/L.

1:protein laDDer;2:全細胞破碎液;3:離心上清液;4:過柱流出液;5:Ni柱平衡液;6～9:含120 mmol/L咪唑的洗脫液;10～13:含160 mmol/L咪唑的洗脫液圖2 N-糖酰胺酶F的表達與純化

2.3 N-糖酰胺酶F的脫糖基化作用

圖3 N-糖酰胺酶F對SNAT2的脫糖基化作用

為了檢測純化的N-糖酰胺酶F的脫糖基化作用,將20 μg含SNAT2的總蛋白與不同量的N-糖酰胺酶F混合,37 ℃溫浴1.5 h后,進行Western-blot檢測分析(圖3).加入N-糖酰胺酶F后,SNAT2的條帶明顯變窄變清晰,并隨著N-糖酰胺酶F量的增加,SNAT2的遷移率增加,脫糖基化愈發(fā)明顯.在N-糖酰胺酶F的量達到8.8 μg時,SNAT2基本全部脫去糖鏈(圖3泳道5),與商業(yè)化的N-糖酰胺酶F的作用結(jié)果一致(圖3泳道6),表明制備的N-糖酰胺酶F具有正常的脫糖鏈功能,同時證實了SNAT2分子中含有糖基化位點的假設(shè).

為了檢測N-糖酰胺酶F最佳的作用時間,用8.8 μg N-糖酰胺酶F與20 μg 含有SNAT2的總蛋白混合,于37 ℃作用不同時間(0.5～3.0 h),經(jīng)Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)消化1.5 h已將SNAT2基本去糖基化(圖4泳道4).

為了進一步確認純化的N-糖酰胺酶F的脫糖基化作用,用不同量的N-糖酰胺酶F與20 μg 含有SNAT1的總蛋白混合作用1.5 h,經(jīng)western blot檢測,發(fā)現(xiàn)隨著酶量的增加,SNAT1脫糖基化的效果明顯增強,條帶變窄變清晰.與商業(yè)化PNGase F作用結(jié)果比較,13.2 μg N-糖酰胺酶F可完全脫去SNAT1的糖鏈(圖5泳道5).該結(jié)果同樣證實了SNAT1分子中含有糖基化位點的假設(shè).

圖4 N-糖酰胺酶F對SNAT2的最佳消化時間測定

圖5 N-糖酰胺酶F對SNAT1的脫糖基化作用

3 討 論

首先對N-糖酰胺酶F的誘導表達條件進行了研究,分別進行了16 ℃低溫誘導和37 ℃誘導2種方法.37 ℃誘導表達時,蛋白大部分都形成了包涵體(結(jié)果沒有顯示),16 ℃誘導時有大量蛋白可溶性表達,并且隨著誘導時間的增加蛋白表達量增加,10 h 時基本達到一個穩(wěn)定值(結(jié)果沒有顯示).經(jīng)16 ℃低溫誘導10 h后,獲得大量的可溶性N-糖酰胺酶F(圖2泳道3).細胞裂解上清液利用含有不同濃度的咪唑洗脫液洗脫后(50 ～ 240 mmol/L),發(fā)現(xiàn)120 mmol/L咪唑洗脫液可洗下部分N-糖酰胺酶F(圖2泳道6～9),160 mmol/L咪唑洗脫液可洗下大量N-糖酰胺酶F,并且純度在95%以上(圖2泳道10～13).

為了檢測純化的N-糖酰胺酶F脫糖基化功能,以中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SNAT1和SNAT2為底物,通過檢測N-糖酰胺酶F消化SNAT1和SNAT2后在SDS-PAGE中的遷移率的變化來研究N-糖酰胺酶F的脫糖基化作用.當消化時間為1.5 h 時,8.8 μg的PNGase F能將20 μg總蛋白中的SNAT2完全去糖基化(圖3),13.2 μg的PNGase F能將20 μg總蛋白中的SNAT1的完全去糖基化(圖5),分子量分別降低約15 kDa,表明純化的PNGase F具有高效的脫糖基化功能,同時證實了SNAT1和SNAT2分子中含有糖基化位點的假設(shè).這對研究SNAT1和SNAT2的結(jié)構(gòu)與功能提供了有效的工具.

目前,還沒有特別快速有效的方法得到大量可溶性表達的N-糖酰胺酶F,Su等[20]通過純化包涵體和可溶性蛋白兩部分得到了N-糖酰胺酶F,但大部分是在包涵體中獲得的.商業(yè)化的N-糖酰胺酶F價格非常昂貴,阻礙了N-糖酰胺酶F的廣泛應(yīng)用以及糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究.在本研究中,通過分子生物學方法構(gòu)建了大腸桿菌表達載體pET28a-PNGase F,在大腸桿菌中大量表達了可溶性N-糖酰胺酶F,通過簡單的Ni柱一步純化,獲得了純度高達95%以上的N-糖酰胺酶F,既避免了純化包涵體的復雜性,又能得到了高純度可溶性表達的N-糖酰胺酶F.經(jīng)對中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SNAT1和SNAT2脫糖鏈作用的檢測,證明本研究中純化的N-糖酰胺酶F作用的有效性,同時證實了SNAT1和SNAT2是含有糖基化位點的糖蛋白.今后,N-糖酰胺酶F將作為一種有效的工具酶應(yīng)用到SNAT1和SNAT2的結(jié)構(gòu)與功能研究中.

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