響應(yīng)面法優(yōu)化玉米麩質(zhì)水中醇溶蛋白提取工藝

劉曉陽(yáng) ，張國(guó)治 ，黃紀(jì)念 ，宋國(guó)輝

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002）

0 引言

玉米醇溶蛋白（zein）最早是被Gorham在1821年發(fā)現(xiàn)的，最初命名為India protein；由于其可溶于乙醇等醇類溶液，在1924年被Osborne歸類為醇溶蛋白.而現(xiàn)在認(rèn)為玉米醇溶蛋白包括可溶于60%～90%醇類溶液的醇溶谷蛋白，也包括溶于含有還原劑的低濃度醇類溶液的蛋白質(zhì)，這些蛋白都位于玉米醇溶蛋白體中[1].玉米醇溶蛋白獨(dú)特的氨基酸組成及其分子形狀和結(jié)構(gòu)，決定了它獨(dú)特的溶解性、成膜性、吸濕性、耐熱性和耐脂性，可用于果蔬保鮮，生產(chǎn)可降解塑料、黏合劑、脂肪的模擬品及緩釋微膠囊、降壓肽和高F值肽等功能性多肽[2-3].可見(jiàn)玉米醇溶蛋白具有廣泛的應(yīng)用前景.

玉米胚乳蛋白主要為醇溶蛋白，占胚乳蛋白總量的60%，還含有26%的谷蛋白以及少量的球蛋白和清蛋白，后兩者共占胚乳總蛋白的6%左右[4].在玉米淀粉生產(chǎn)過(guò)程中，大部分清蛋白和球蛋白被降解，溶于浸泡水中.玉米醇溶蛋白和谷蛋白的二硫鍵被還原，谷蛋白被部分溶解，而玉米醇溶蛋白在酸性溶液中即使在加熱情況下也不會(huì)溶解，幾乎完全保留在玉米麩質(zhì)水沉淀物中[5].

玉米醇溶蛋白提取的原料主要有：濕磨法生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)品玉米蛋白粉和玉米生料發(fā)酵生產(chǎn)的乙醇剩余酒糟蛋白飼料和干磨玉米粉.目前商品玉米醇溶蛋白生產(chǎn)大都以玉米蛋白粉為原料[6-7].由于玉米蛋白粉經(jīng)過(guò)高溫干燥過(guò)程可能造成蛋白變性，且玉米蛋白粉質(zhì)地堅(jiān)硬，難以破碎，從中提取玉米醇溶蛋白較為困難，需要用有機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間浸提.故考慮從玉米麩質(zhì)水離心、壓濾得到的沉淀中直接提取玉米醇溶蛋白.作者采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以玉米淀粉生產(chǎn)的麩質(zhì)水沉淀為原料，玉米醇溶蛋白提取率為指標(biāo)，優(yōu)化玉米醇溶蛋白提取工藝得出最佳條件.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

玉米淀粉生產(chǎn)麩質(zhì)水：河南中鶴集團(tuán).

乙醇、氫氧化鈉、鹽酸:市售，均為分析純.

1.2 儀器

DFY-1000搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DL-5-B低速離心機(jī)：上海市安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；K-05型自動(dòng)定氮儀：上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白的提取

玉米麩質(zhì)水經(jīng)過(guò)離心分離、氣浮濃縮和板框壓濾得到玉米麩質(zhì)水沉淀，粉碎后稱取5 g于100 mL圓底燒瓶中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，以試驗(yàn)設(shè)定的溫度、液料比和時(shí)間進(jìn)行提取.提取結(jié)束后，以5 000 r/min離心15 min，收集上清液，沉淀在提取谷蛋白時(shí)備用.將提取條件優(yōu)化后得到的玉米醇溶蛋白提取液減壓濃縮至一定濃度（無(wú)蛋白沉淀析出，未呈凝膠狀態(tài)時(shí)），加入2倍體積的蒸餾水降低乙醇體積分?jǐn)?shù)，使醇溶蛋白沉淀，以5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀在烘箱中干燥或真空中冷凍干燥得到成品.

1.3.2 測(cè)定方法

原料、提取液和玉米醇溶蛋白成品的蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定[8].

式中：c為提取液中玉米醇溶蛋白的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；a為原料蛋白含量（濕基），m為原料質(zhì)量，g.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

玉米醇溶蛋白是由分子大小、溶解能力和荷電不同的肽通過(guò)二硫鍵聚合起來(lái)的非均相混合物，平均分子質(zhì)量為44 ku，可溶于60%～90%的醇類溶液[9].單因素試驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、提取溫度（℃）、液料比（V/W）、提取時(shí)間（min）4個(gè)因素考察其對(duì)醇溶蛋白提取率的影響.

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

稱取5 g原料于100 mL圓底燒瓶中，分別加入 45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%的乙醇溶液30 mL，50℃下回流提取20 min，以5 000 r/min離心15 min，取上清液用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量并計(jì)算提取率.乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響如圖1所示.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

由圖1和單因素方差分析結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響顯著.玉米醇溶蛋白的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，75%的乙醇溶液提取率最高，幾乎不溶于45%的乙醇溶液和無(wú)水乙醇.說(shuō)明以提取率為指標(biāo)時(shí)，提取玉米醇溶蛋白的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%.

2.1.2 提取溫度對(duì)提取率的影響

稱取5 g原料于100 mL圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液 30 mL，分別在 30、40、50、60、70 ℃溫度下回流提取20 min，以5 000 r/min離心15 min，取上清液用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量計(jì)算提取率.提取溫度對(duì)提取率的影響如圖2所示.

圖2 提取溫度對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

由圖2和單因素方差分析結(jié)果可知，提取溫度對(duì)提取率的影響顯著.其他條件固定，隨著溫度升高，提取率不斷升高.但是溫度過(guò)高耗能過(guò)大，且還可能使部分蛋白變性，Malumaba等[10]發(fā)現(xiàn)在溫度上升到80℃時(shí)，從玉米粉中提取玉米醇溶蛋白的得率顯著下降，可能與二硫鍵的生成與轉(zhuǎn)化有關(guān)，另外疏水相互作用、肽鏈的折疊以及與其他物質(zhì)生成新的化合鍵，也可能導(dǎo)致溶解度的降低.綜合考慮提取率和能耗響應(yīng)面優(yōu)化提取溫度應(yīng)選擇60℃.

2.1.3 液料比對(duì)提取率的影響

稱取5 g原料于100 mL圓底燒瓶中，分別加入 20、30、40、50、60 mL 的 75%乙醇溶液，60 ℃下回流提取20 min，以5 000 r/min離心15 min，取上清液用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量計(jì)算提取率.液料比對(duì)提取率的影響如圖3所示.

圖3 液料比對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

由圖3和單因素方差分析結(jié)果可知，液料比對(duì)提取率的影響顯著.其他條件固定，隨著液料比增大，提取率不斷升高.液料比12∶1和10∶1的提取率相當(dāng)；液料比8∶1與6∶1差異不顯著，液料比較低的條件下提取一段時(shí)間后，溶液中玉米醇溶蛋白的濃度較高，影響了傳質(zhì)效率，在提取時(shí)間一定時(shí)，增加溶劑的用量可以提高玉米醇溶蛋白的提取率，但消耗溶劑過(guò)多，生產(chǎn)成本提高，因此選取液料比6∶1為優(yōu)化試驗(yàn)起點(diǎn)較為合適.

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取5 g原料于100 mL圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液30 mL，分別于60℃下回流提取10、20、30、40、50 min，以 5 000 r/min 離心 15 min，取上清液用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量計(jì)算提取率.提取時(shí)間對(duì)提取率影響如圖4所示.

圖4 提取時(shí)間對(duì)與玉米醇溶蛋白提取率的影響

由圖4和單因素方差分析結(jié)果可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率有所增高，但30 min以后提取率基本保持不變，說(shuō)明玉米麩質(zhì)水壓濾餅粕中的醇溶蛋白，由于未經(jīng)過(guò)高溫干燥過(guò)程，在75%乙醇中的溶解性較好、溶出速率較快.所以將響應(yīng)面試驗(yàn)的時(shí)間固定為30 min，不再對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化.

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

稱取5 g原料于100 mL圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液30 mL，60℃下回流提取 30 min，以5 000 r/min離心15 min，取上清用液凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量計(jì)算提取率.重復(fù)上述兩次操作過(guò)程，分別以每次離心沉淀的殘?jiān)鼮樵希看谓岬奶崛÷式Y(jié)果，如圖5所示.

由圖5可知，提取率隨著提取次數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，但第一次提取時(shí)提取率已達(dá)到（75.49±0.21）%，二次提取時(shí)提取率增幅為7.17%，進(jìn)行3次提取時(shí)，提取率僅增加了（0.46±0.059）%.經(jīng)一次提取就可以達(dá)到較高的提取率.雖然，進(jìn)行多次提取提取率有所升高，但要消耗更多的溶劑和時(shí)間，得到的產(chǎn)品價(jià)值不能彌補(bǔ)生產(chǎn)成本的增加，所以選擇一次提取.

圖5 提取次數(shù)對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定玉米醇溶蛋白提取的最佳工藝.利用SAS軟件采用中心組合試驗(yàn)Box-Behenken設(shè)計(jì)方案[11-12]，以提取率為響應(yīng)值Y，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取溫度（X2）、液料比（X3）為因素對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1.

表1 試驗(yàn)因素與水平

利用SAS軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，建立回歸方程并確定最佳方案.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用SAS軟件，對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到玉米醇溶蛋白提取率的二次多項(xiàng)回歸方程為：

該模型的方差分析如表3所示.

表3 方差分析

由表3可知，試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（p=0.002 2），失擬項(xiàng)在p=0.05水平上不顯著（p=0.31＞0.05），其決定系數(shù) R2為 0.972 4，表明此模型擬合較好，可以用此回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析.提取溫度的一次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），說(shuō)明其對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的線性效應(yīng)顯著.回歸模型的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都極顯著，說(shuō)明各因素與響應(yīng)值（提取率）之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；交互項(xiàng)在p=0.05水平上不顯著（p=0.75＞0.05），說(shuō)明交互作用不顯著.

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)曲面圖分析

通過(guò)SAS軟件輸出的響應(yīng)面試驗(yàn)的曲面（圖6—圖8），能更直觀地反映各因素對(duì)于提取率的影響規(guī)律.整體而言，在試驗(yàn)選定的條件下，提取溫度對(duì)于提取率的影響最為顯著，隨著提取溫度的升高提取率不斷升高；乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，75%的乙醇溶液提取率最高；相對(duì)于其他兩個(gè)因素，液料比對(duì)提取率的影響較小.

由圖6可知，在試驗(yàn)選定的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響相比，提取溫度更為重要，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取溶劑時(shí)，隨著提取溫度的升高，提取率顯著增高，隨著提取溫度的升高，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響有所增加.

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)提取率影響的曲面

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對(duì)提取率影響的曲面

由圖7可知，在試驗(yàn)選定的條件下，液料比對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響不大，中間水平體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，更適于作為玉米醇溶蛋白的提取溶劑，較高水平比低水平體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液提取率更高.

圖8 提取溫度與液料比對(duì)提取率影響的曲面圖和等高線圖

由圖8可知，在試驗(yàn)選定的條件下，提取溫度與液料比對(duì)玉米醇溶蛋白提取率的影響相比，提取溫度更為重要，隨著提取溫度的升高，提取率顯著增高，在高溫區(qū)域液料比對(duì)提取率的影響更小.

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)與結(jié)果分析

通過(guò)SAS軟件分析，由模型得到的二次多項(xiàng)回歸方程預(yù)測(cè)玉米醇溶蛋白的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)74.49%，提取溫度67.95℃，液料比7.45∶1；玉米醇溶蛋白提取率的預(yù)測(cè)值為（82.29±0.67）%.考慮到實(shí)際的操作和工業(yè)實(shí)際情況，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)74.5%，提取溫度68℃，液料比7.5∶1（V/W）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到玉米醇溶蛋白的提取率為（82.17±0.24）%，與預(yù)測(cè)值無(wú)明顯差異.因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米醇溶蛋白提取的最佳條件數(shù)據(jù)可靠，具有應(yīng)用價(jià)值.回收得到的玉米醇溶蛋白固體的蛋白含量為87.66%，回收效率為（90.86±1.2）%.

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到玉米醇溶蛋白提取的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)74.5%，提取溫度 68℃，液料比 7.5∶1（V/W），提取時(shí)間 30 min時(shí)醇溶蛋白的提取率最高可達(dá)82.17%，純度為87.66%.與從玉米蛋白粉中提取玉米醇溶蛋白需要1.5～2 h相比，直接從玉米麩質(zhì)水沉淀中提取在提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取率已經(jīng)達(dá)到最高[13-14].從玉米麩質(zhì)水氣浮沉淀，壓濾后得到的餅粕中直接提取玉米醇溶蛋白，既省去了熱風(fēng)干燥的過(guò)程，降低能耗，又可降低蛋白的變性程度，提高所制備醇溶蛋白的提取率，減少提取時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本.

［1］ Wilson C M.Multiple zeins from maize endosperms characterized by reverse-phase HPLC［J］.Plant Physiol，1991,95:777-786.

［2］ 黃國(guó)平，楊曉泉.玉米醇溶蛋白阿司匹林緩控釋骨架材料的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2005（9）：48-50.

［3］ 李鴻梅，徐力，楊銳，等.玉米醇溶蛋白肽的制備及其對(duì)亞油酸自氧化的抑制作用［J］.中國(guó)油脂，2009，34（9）：19-23.

［4］ Wu S,Myers D J，Johnson L A,et al.Pilotplant wet-milling process for producing corn gluten meal［J］.Cereal Chem，1997,74:264-267.

［5］ 劉亞偉.玉米淀粉生產(chǎn)及轉(zhuǎn)化技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：21-26，32-34.

［6］ Kwiatkowski J R，McAloon A J，Taylor F，et al.Modeling the process and costs of fuel ethanol production by the corn dry-grind process［J］.Crops Prod，2006,23:288-296.

［7］ White P J，Jonhson L A.Corn Chemistry and Technology［M］.ST paul MN:AACC，2003.

［8］ GB/T 5009.5—2003，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］.

［9］ Pomes A F，Mark H.Encyclopedia of polymer science and technology［M］.New York：Wiley，1971，15:125-132.

［10］ Malumba P，Janas S，Masimango T.Influence of drying temperature on the wetmilling performance and the proteins solubility indexes of corn kernels［J］.Journal of Food Engineering，2009,95:393-399.

［11］李夢(mèng)琴，李運(yùn)罡，張劍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化玉米谷蛋白凝膠制備工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（11）：241-245.

［12］梁桂兆，卞科.基于響應(yīng)面分析法的可食性小麥蛋白膜的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25（5）：70-75.

［13］相恒緒，陳琦，敬思群.玉米醇溶蛋白提取工藝選擇與優(yōu)化［J］.鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，26（1）：34-38.

［14］張旭，于國(guó)萍.玉米蛋白粉中醇溶蛋白提取方法的研究［J］.糧食加工，2007，32（2）：41-45.