利用克雷伯氏菌B-36生產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

張開平 ，惠 明 ，田 青

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.百色學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 百色 533000）

0 前言

脂肪酶（EC3.1.1.3）又稱三?；视退饷?，是一類能在油水界面或水不溶性系統(tǒng)中催化脂類物質(zhì)水解、酯化、醇解、酯交換等化學(xué)反應(yīng)的生物催化劑[1]，具有化學(xué)選擇性、立體選擇性和底物專一性等特點，是當(dāng)代酶工業(yè)最受矚目的酶種之一[2-3].近年來，人們對脂肪酶耐熱、耐酸等酶學(xué)特性提出了新的要求，且已成為國內(nèi)外一個新的研究熱點[4-5].酸性脂肪酶廣泛地應(yīng)用于食品風(fēng)味改進(jìn)、油脂水解與改性、皮革脫脂、藥物修飾、生物柴油等工業(yè)領(lǐng)域，但許多工業(yè)用脂肪酶在生產(chǎn)中由于耐熱或耐酸性較差而失活，或酶作用的最適溫度和pH值不在生產(chǎn)工藝要求范圍內(nèi)而受限制[6-7].因此，尋找和分離能高效產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶菌株具有一定的科研與生產(chǎn)應(yīng)用價值，目前，在國內(nèi)外有關(guān)克雷伯氏菌產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶的報道較少，克雷伯氏菌B-36（Klebsiella sp.B-36）脂肪酶的發(fā)現(xiàn)豐富了脂肪酶的種類，為脂肪酶耐熱、耐酸特性的研究提供了新的材料.作者從鄭州煉油廠富含油污的土樣中分離鑒定了一株產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶菌株Klebsiella sp.B-36，探討該菌株產(chǎn)酶條件和影響因素，為酸性脂肪酶的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

Klebsiella sp.B-36由實驗室保藏.

種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO41.0，（NH4）2SO45.0，葡萄糖 10.0，橄欖油 10.0 mL，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 5.0，酵母膏 20.0，蔗糖 20.0，MgSO4·7H2O 1.0，（NH4）2SO42.0，K2HPO41.0，橄欖油 10.0 mL，pH 6.0.

1.2 培養(yǎng)方法

挑取一環(huán)菌種接到種子培養(yǎng)基中，在40℃，160 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h后，接入二級種子液中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 h.

1.3 分析方法

1.3.1 酶活力測定

按 GB/T 23535—2009測定.將發(fā)酵液于 4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液測酶活.酶活定義（U）：1 mL液體酶，在40℃和pH 7.5條件下，反應(yīng)15 min，每分鐘水解底物產(chǎn)生1μmol可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位（U），以U/mL表示.

1.3.2 試驗設(shè)計

以酶活力為指標(biāo)，研究產(chǎn)酶條件初始pH值、溫度、裝液量以及接種量對菌株產(chǎn)酶的影響，每個試驗點重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)用SAS6.12軟件進(jìn)行方差分析，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示[8].在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以pH值、溫度、裝液量以及接種量為變量，以菌株產(chǎn)酶活力為響應(yīng)值，設(shè)計了4因素3水平共27個試驗點的響應(yīng)面分析試驗[9].

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初始p H對菌體產(chǎn)脂肪酶活力的影響

菌體在生長和產(chǎn)酶過程中，培養(yǎng)基的pH是變動的，因此研究培養(yǎng)基的初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響至關(guān)重要.將初始pH值分別調(diào)至3.0～9.0，間隔1個pH單位，40℃，160 r/min條件下培養(yǎng) 60 h后，發(fā)酵液離心取上清液測脂肪酶活力，結(jié)果見圖1.由圖1可知，在pH低于5.0時，酶活力隨pH上升而逐漸升高，在pH大于5.0之后，隨著pH上升，酶活力反而下降，因此，選擇培養(yǎng)基初始pH值為5.0，此時發(fā)酵液酶活力相對較高.經(jīng)SAS軟件方差分析P＜0.05，說明pH對酶活力影響顯著.

圖1 培養(yǎng)基初始pH值對Klebsiella sp.B-36產(chǎn)脂肪酶的影響

2.2 溫度對產(chǎn)酶的影響

將菌體分別置于 30～60℃，間隔 5℃，pH 5.0，160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)60 h后測酶活，結(jié)果見圖2.由圖2可知，隨著溫度的上升，Klebsiella sp.B-36產(chǎn)脂肪酶活力逐漸升高，當(dāng)溫度升高至45℃時酶活力達(dá)到最大，為17.67 U/mL，之后隨著溫度升高，酶活開始下降，因此，選擇培養(yǎng)溫度為45℃.經(jīng)SAS軟件方差分析P＜0.05，說明溫度對酶活力影響顯著.

2.3 不同接種量對產(chǎn)酶的影響

接種量對菌體的發(fā)酵周期以及產(chǎn)酶能力具有重要影響.接種量過大，菌體增長過快以及帶入過多種子代謝物，進(jìn)而使菌體老化，菌體活力降低，不利于穩(wěn)定產(chǎn)酶.若接種量過小，菌體增長緩慢，發(fā)酵周期延長，菌體活力下降.因此，合適的接種量，既可以縮短發(fā)酵周期，又可以獲得較高的產(chǎn)酶水平.接種量分別為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，pH 5.0，裝液量 60 mL，45 ℃，160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)60 h后測酶活，結(jié)果見圖3.由圖3可知，酶活力隨著接種量的增加而逐漸升高，隨后又逐漸下降，當(dāng)接種量為2%時酶活力最高，為17.89 U/mL，因此，選擇接種量為 2%.經(jīng)SAS軟件方差分析P＜0.05，說明接種量對酶活力影響顯著.

圖2 溫度對Klebsiella sp.B-36產(chǎn)脂肪酶的影響

圖3 接種量對Klebsiella sp.B-36產(chǎn)脂肪酶的影響

2.4 不同裝液量對Klebsiella sp.B-36產(chǎn)酶的影響

搖瓶和轉(zhuǎn)速一定時，裝液量是控制發(fā)酵液溶氧量的主要因素.在250 mL三角瓶中分別裝20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 5.0，45℃，160 r/min培養(yǎng)60 h后測酶活，結(jié)果見圖4.由圖4可知，當(dāng)裝液量低于60 mL時酶活隨著裝液量的增大而升高；當(dāng)裝液量增加到60 mL時，酶活達(dá)到最高；之后隨著裝液量的增加，酶活逐漸降低.因此，選擇60 mL的裝液量進(jìn)行搖瓶發(fā)酵.經(jīng)SAS軟件方差分析P＜0.05，說明裝液量對酶活力影響顯著.

圖4 裝液量對Klebsiella sp.B-36產(chǎn)脂肪酶的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗條件，以pH值（A）、溫度（B）、裝液量（C）以及接種量（D）為變量，菌株酶活力為響應(yīng)值（Y），用Design-Expert 7.0 Trial軟件通過中心組合法尋求最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)[10-11]，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1，方差分析見表2，根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析見圖5.

試驗數(shù)據(jù)用Design-Expert 7.0 Trial軟件進(jìn)行二次回歸擬合后，得到回歸方程為：

Y=-199.455 83+23.030 83A+1.938 17B+2.087 25C+54.521 67D-0.004AB-0.111 75AC+0.065AD+0.000 35BC-0.015BD-0.005 5CD-1.677 92A2-0.020 517B2-0.012 917C2-12.706 67D2.

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果

表2 方差分析

圖5 響應(yīng)面的立體分析

由表2可以看出，模型的P值在α=0.000 1水平上顯著.同時模型中自變量一次項A，B，D，二次項 AC，A2，B2，C2，D2顯著（α=0.05）. 模型失擬項不顯著，則模型選擇得合適.因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析.同時，由軟件分析得到模型的校正決定系數(shù)R2為0.957 3，大于0.90，說明該模型最多只有約4.27%的變化不能用此模型來解釋.試驗偏差系數(shù)（CV）為2.16%，其值較低，能由該模型解釋，進(jìn)一步說明模型擬合度較好[12].

對回歸方程進(jìn)行分析，得出最佳發(fā)酵條件為：pH 4.9，溫度46.5℃，裝液量60 mL，接種量2.1%，酶活力為21.8 U/mL.采用最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行產(chǎn)酶試驗，重復(fù) 3 次，酶活力為（21.7±0.1）U/mL，與模型預(yù)測值接近，說明該模型可靠.

3 結(jié)論

以自行篩選鑒定的一株耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌Klebsiella sp.B-36為研究對象，采用單因素試驗和Box-Benhnken響應(yīng)面分析法對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了優(yōu)化發(fā)酵條件為：初始pH值4.9，溫度46.5℃，250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量2.1%（V/V），在最優(yōu)發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)酸性脂肪酶活力達(dá)到21.8 U/mL，具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價值.

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