響應(yīng)面法優(yōu)化八寶景天葉總黃酮的超聲提取工藝

吳現(xiàn)芳，趙成愛，余梅燕，楊琳琳，徐偉強

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林長春130118)

八寶景天(Sedum spectabile Boreau)，又名蝎子草、華麗景天、長藥景天等［1］，俗稱八寶、胡豆七，活血三七，系景天科景天屬植物，以全草入藥，全年可采，多鮮用。其性平、味苦、微酸，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、止血止痛和清熱解毒的功效［2］。研究表明景天屬植物中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如生物堿、甾體、鞣質(zhì)、黃酮、縮合單寧和生氰化合物等［3］。其中黃酮類有效成分在清熱解毒、抗氧化、抑菌、抗癌等方面有顯著效果［4］。目前八寶景天主要作為觀賞植物用于園林綠化，對其較高的藥用價值研究較少，對八寶景天葉尤其是總黃酮的研究更少。因此，本文旨在研究八寶景天葉中總黃酮的提取工藝，為八寶景天葉的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持［5］。近年來，超聲技術(shù)已普遍應(yīng)用于提取植物中生物活性物質(zhì)，它具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點，但超聲技術(shù)應(yīng)用于提取八寶景天葉中黃酮類物質(zhì)的研究尚未見報道［6］。本文研究了影響八寶景天葉總黃酮超聲提取效果的各因素，并通過響應(yīng)面分析法，確定了最佳提取工藝條件，為進一步開發(fā)利用八寶景天葉的藥用價值提供了可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八寶景天(Sedum spectabile Boreau)葉 采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園，干燥、粉碎，密封備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等 均為分析純。

JFSD-100粉碎機 上海淀久中藥機械制造有限公司;KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;722E型光柵分光光度計 山東高密彩虹分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法 準(zhǔn)確稱取120℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，用適量70%乙醇充分溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻制成濃度為0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取該標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于10mL比色管中，加5%亞硝酸鈉水溶液0.30mL，搖勻，放置6min;加10%硝酸鋁0.30mL，搖勻，放置6min;再加4%氫氧化鈉4.00mL，搖勻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，在510nm處測定吸光度［7］。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 八寶景天葉總黃酮的測定方法 將新鮮的八寶景天葉烘干，粉碎并過60目篩，用實驗設(shè)定的提取條件進行超聲提取。提取液趁熱減壓抽濾，濾液定容，即得供試品溶液。精密量取1.0mL供試品溶液于10mL比色管中，按1.2.1項方法平行測定三次，計算總黃酮提取率。

式中:C為比色管中測量液的總黃酮濃度，mg/mL;V1為測量液的定容體積，10mL;V2為測量時量取的體積，1.0mL;V3為提取液的定容體積，50mL;m為八寶景天葉干粉的質(zhì)量，1000mg。

1.2.3 超聲波輔助提取總黃酮的單因素實驗 分別選取不同的乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度進行單因素實驗，考察各單因素對八寶景天葉總黃酮提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化總黃酮的提取條件 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進一步考察乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間對八寶景天葉總黃酮提取效果的影響，利用Design Expert 7.0.0軟件，根據(jù)中心組合實驗設(shè)計原理，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，對超聲提取條件進行優(yōu)化，因素水平安排見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素及水平Table 1 Factors and levels in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示?；貧w方程為:A=11.779C+0.0072，R2=0.9996，表明蘆丁在 0.01～0.06mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 在液料比20∶1，超聲溫度 40℃，超聲時間 20min的條件下，分別研究乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%、95%對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，黃酮提取率增高，當(dāng)乙醇濃度為70%時，達到最高，超過70%后，提取率有所下降?？赡苁且驗橐掖紳舛冗^高，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭乙醇，從而導(dǎo)致總黃酮提取率下降［8］。因此，乙醇濃度以70%為宜。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of concentration of ethanol on extraction of total flavonoids

2.2.2 液料比對總黃酮提取率的影響 在乙醇濃度70%，水浴40℃，超聲20min的條件下，分別研究液料比 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1mL/g 對八寶景天葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of total flavonoids

由圖3可知，當(dāng)液料比小于20∶1時，隨液料比的增加，總黃酮提取率明顯增大，超過20∶1時，再增大液料比，提取率趨于穩(wěn)定?？赡芤驗?0∶1的溶劑已將黃酮類成分基本溶出完全，綜合考慮黃酮提取率、溶劑用量、能量損耗等因素，故選擇液料比20∶1為宜。

2.2.3 超聲溫度對八寶景天葉總黃酮提取率的影響

在乙醇濃度70%，液料比20∶1，超聲20min的條件下，分別研究水浴超聲溫度 30、40、50、60、70、80℃對八寶景天葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著溫度升高，提取率增高，在60℃達到最大值，隨著溫度繼續(xù)升高，提取率下降。通常情況下，溫度升高能加快分子的運動速度和滲透擴散能力，加快物質(zhì)的溶出率，但是過高的溫度會氧化破壞黃酮類化合物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其提取率下降，所以選60℃為宜。

圖4 超聲溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on the yield of total flavonoids

2.2.4 超聲時間對八寶景天葉總黃酮提取率的影響在乙醇濃度70%，液料比20∶1，60℃水浴的條件下，分別研究超聲 10、20、30、40、50、60min 對八寶景天葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on the yield of total flavonoids

由圖5可知，黃酮提取率在超聲10min時較低，40min時明顯增高，此后再延長超聲時間，提取率稍有下降?？赡苡捎陂L時間超聲波處理，溶液溫度逐漸上升，影響了黃酮類化合物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致提取率下降。從節(jié)約時間上考慮，選40min為宜。

2.3 響應(yīng)面分析實驗

2.3.1 實驗設(shè)計及結(jié)果 綜合單因素實驗結(jié)果，以乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間為影響因素，以總黃酮提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析實驗［9］，實驗設(shè)計及結(jié)果見表 2。

采用Design expert 7.0.0軟件對表2中實驗結(jié)果進行多項擬合回歸，得到總黃酮提取率對乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間的二次多項回歸模型:Y=3.0604+0.0983A+0.0801B+0.00192C+0.0963D+0.0748AB-0.0405AC+0.0415AD+0.0835BC+0.0565BD+0.0293CD-0.319A2-0.303B2-0.0501C2-0.0861D2。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 為了檢驗回歸方程的有效性，進一步確定各因素對總黃酮提取率的影響程度，對回歸模型進行了方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型的p＜0.0001，差異極顯著;失擬項的p值為0.5549，不顯著，決定系數(shù)R2=0.9648，響應(yīng)值的變化有96.48%來源于所選因素，即來源于乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間。表明此模型擬合度較好，回歸方程能很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，該實驗方法可靠［10］。

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

回歸模型一次項A和D的p值均小于0.0001，表明其對總黃酮提取率影響極顯著，B的p值小于0.01，表明其對總黃酮提取率影響高度顯著;交互項AB和BC影響顯著，其余不顯著;二次項A2、B2、均達到極顯著水平，D2強顯著，C2不顯著。表明各因素對總黃酮提取率存在交互影響，而不是簡單的線性關(guān)系［11］。響應(yīng)曲面圖可以形象地描述各因素之間的相互作用，如圖6～圖11所示。

圖6 乙醇濃度和液料比對總黃酮提取率的交互影響Fig.6 Effect of concentration of ethanol and liquid-to-material ratio on the yield of total flavonoids

響應(yīng)曲面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感;反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對響應(yīng)值的影響也就越?。?2］。圖6～圖11直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，乙醇濃度和液料比、液料比和超聲溫度交互作用曲面陡峭，表明其對總黃酮提取率的交互作用明顯。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖7 乙醇濃度和超聲溫度對總黃酮提取率的交互影響Fig.7 Effect of concentration of ethanol and ultrasonic extraction temperature on the yield of total flavonoids

圖8 乙醇濃度和超聲時間對總黃酮提取率的交互影響Fig.8 Effect of concentration of ethanol and ultrasonic extraction time on the yield of total flavonoids

圖9 液料比和超聲溫度對總黃酮提取率的交互影響Fig.9 Effect of liquid-to-material ratio and ultrasonic extraction temperature on the yield of total flavonoids

圖10 液料比和超聲時間對總黃酮提取率的交互影響Fig.10 Effect of liquid-to-material ratio and ultrasonic extraction time on the yield of total flavonoids

通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，Design expert 7.0.0軟件對回歸方程進行計算，得到超聲提取八寶景天葉總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度72.12%，液料比21.42∶1mL/g，超聲溫度 63.98℃，超聲時間 47.71min;在此條件下模型預(yù)測總黃酮提取率為3.12%?？紤]到實際操作條件的局限性，對最佳工藝條件進行如下修正:乙醇濃度72%，液料比21∶1mL/g，超聲溫度為64℃，超聲時間48min。根據(jù)此條件進行了3次平行驗證實驗，結(jié)果八寶景天葉中總黃酮的平均提取率為 3.116%，與模型預(yù)測值一致(相對誤差0.11%)。說明實驗結(jié)果與模型擬合良好，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的超聲提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

圖11 超聲溫度和超聲時間對總黃酮提取率的交互影響Fig.11 Effect of ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time on the yield of total flavonoids

3 結(jié)論

八寶景天葉中含有豐富的黃酮類化合物，具有很好的藥用價值和開發(fā)利用前景。本實驗以干燥的八寶景天葉粉末為原料，以乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取技術(shù)，在單因素實驗基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面實驗對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果表明最佳的操作條件為:乙醇濃度為72%，液料比21∶1mL/g，超聲溫度為 64℃，超聲時間 48min。優(yōu)化得到的最佳提取工藝是提取八寶景天葉黃酮類化合物的有效途徑，為進一步開發(fā)其藥用成分提供了可靠依據(jù)。

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