高效液相色譜 熒光法測定臘肉中的苯并芘殘留

李念念，周光宏，徐幸蓮，劉登勇，李春保

(南京農(nóng)業(yè)大學，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇南京210095)

苯并芘又稱3，4-苯并芘，簡稱Bap，是一種含5個環(huán)的稠環(huán)芳烴，是由一個苯環(huán)和一個芘分子結(jié)合而成的多環(huán)芳烴類化合物，是多環(huán)芳烴類化合物(PAHs)的代表，具有多種同分異構(gòu)體，廣泛存在于各種食品中［1］。目前，已發(fā)現(xiàn)的400多種致癌物中，1/2以上屬于多環(huán)芳烴類化合物，其中，苯并芘是致畸、致突變和致癌性物質(zhì)的代表［2］。小劑量苯并芘就有可能引起局部組織的癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細胞DNA、肺細胞及肝細胞損傷［3-5］。目前，由食品污染所導致的疾病已成為全世界最為廣泛關注的食品安全問題之一，許多國家已將Bap列為食品有害物質(zhì)監(jiān)測的重要內(nèi)容之一，德國已對肉制品中Bap的殘留制定了限量標準1μg/kg，歐盟規(guī)定煙熏劑中 Bap 的含量不超過 0.03μg/kg［6］，我國國標限定糧食和肉制品中Bap的殘留量應在5μg/kg以下，植物油中為 10μg/kg［7］。目前，國內(nèi)外已報道大氣［8］、肉類食品［9-12］、反應香精［13］、茶葉［14］、水產(chǎn)品［15］、植物油［16］、土壤［17］中苯并芘的檢測方法有熒光分光光度法［18］、薄層層析法［19］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［20］和高效液相色譜法［9-16］。其中，高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高和檢出率高的優(yōu)點，且易推廣，是目前使用最廣泛的方法，但此法通常需要固相萃取小柱對樣品進行凈化，固相萃取存在操作繁瑣、成本高、耗時等缺點，樣品多時無法滿足檢測的要求。因此，本實驗在參考有關文獻［9-11，13-16］的基礎上，簡化了苯并芘的提取過程，建立了一種適用于檢測臘肉中苯并芘含量的快速、準確的檢測方法，為食品安全檢測提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

苯并芘標準品(純度 ＞99%) 美國Sigma公司;甲醇 德國Meker公司，色譜純;正己烷 美國Fisher公司，色譜純;KOH、Na2S·9H2O 上海試劑有限公司，分析純;臘肉 超市購買。

MDL9000(B)-H-30型臺式實驗室超純水系統(tǒng)南京總馨純水設備公司;Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng)、Waters2475熒光檢測器、Waters X BridgeTMC18柱(4.6mm ×250mm，5μm) 美國 Waters公司;SHIMADZU微量分析天平 日本島津公司;氮吹儀 上海安普有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司;0.22μm有機濾膜。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制 準確稱取苯并芘標準品10mg，置于100mL棕色容量瓶中，甲醇定容，該儲備液(A液)濃度為100μg/mL，避光，放置在4℃冰箱中保存。吸取A液1.00mL于100mL棕色容量瓶中，甲醇定容，該儲備液(B液)濃度為1μg/mL，避光，放置在4℃冰箱中保存。

1.2.2 工作曲線溶液的配制 精密吸取定量B液于100mL容量瓶中，甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5μg/mL 的標準系列，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后，置于樣品瓶中，4℃冰箱保存待用。

1.2.3 液相色譜分析條件 色譜條件如下:色譜柱:Waters X BridgeTMC18(4.6mm ×250mm，5μm);流動相∶V(甲醇)∶V(水)=90∶10;熒光檢測器:激發(fā)波長(λex):365nm，發(fā)射波長 (λem):410nm;流速:1mL/min;柱溫:35℃;進樣量:10μL。

1.2.4 樣品的提取 用電子天平準確稱取用絞肉機絞碎混勻的樣品5g于150mL具塞錐形瓶中，加入30mL 2mol/L KOH(甲醇∶水 =9∶1，V/V)溶液和 2g Na2S·9H2O，塞緊瓶塞，置于70℃恒溫水浴鍋內(nèi)2.5h;取出錐形瓶趁熱加入30mL正己烷，再超聲提取30min;加入30mL水充分振蕩，然后在黑暗中靜置放置直到正己烷相和水相分層。取上層正己烷相15mL經(jīng)氮吹儀吹干，準確加入1.00mL甲醇，超聲溶解后，經(jīng)0.22μm的微孔有機濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

1.2.5 結(jié)果的計算 采用標準物質(zhì)的保留時間對樣品進行定性;定量方法是根據(jù)苯并芘標準液的濃度和色譜峰面積作標準曲線，然后根據(jù)樣品測定時苯并芘的色譜峰面積在標準曲線上找出相應的提取液中苯并芘的濃度，再經(jīng)換算即可得到臘肉中苯并芘的含量，換算公式為

式中:X為樣品中苯并芘含量，μg/kg;C為待測溶液中苯并芘的質(zhì)量濃度，μg/mL;V為樣品濃縮體積(V=1mL);F為正己烷總體積是經(jīng)過氮吹的正己烷體積的倍數(shù)(F=2);m為稱樣質(zhì)量，kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本實驗主要從流動相的組成、流速、檢測器條件、進樣量等幾個方面來進行色譜條件的選擇。比較了幾種流動相，分別為甲醇∶水(70∶30)、甲醇∶水(80∶20)、甲醇∶水(90∶10)，發(fā)現(xiàn)甲醇∶水(90∶10)條件下，苯并芘和樣品中干擾物能達到較好基線分離;在0.6～2.0mL/min范圍內(nèi)改變流動相流速，發(fā)現(xiàn)在流速為1.0mL/min苯并芘出峰時間合適，峰形較好;對苯并芘標準溶液用熒光光譜儀進行掃描，固定激發(fā)波長，其發(fā)射波長為410nm處有最大吸收峰;再固定發(fā)射波長，其激發(fā)波長為365nm處有最大吸收峰;進樣量大可提高測定的靈敏度，但實驗中發(fā)現(xiàn)，當進樣量達到10μL以上時，峰形將發(fā)生分散、拖尾等現(xiàn)象。綜合考慮，本實驗確定測定的色譜條件為:流動相為甲醇∶水(90∶10)，流速 1.0mL/min，柱溫 35℃，激發(fā)波長(λex)為365nm，發(fā)射波長(λem)為410nm，進樣量為10μL，以Waters X BridgeTMC18反相色譜柱作為分離柱，所得苯并芘色譜峰形對稱，基線平穩(wěn)，目標峰和其它雜質(zhì)峰達到完全分離，測定結(jié)果令人滿意。此條件下苯并芘的保留時間為11.44min，標準品及樣品色譜圖見圖1、圖2。

圖1 苯并(a)芘標準色譜圖Fig.1 The chromatograms of benzo(a)pyrene in standard sample

圖2 樣品中苯并(a)芘的色譜圖Fig.2 The chromatograms of benzo(a)pyrene in sample

2.2 樣品前處理條件的選擇

由于肉制品成分復雜，目前國內(nèi)外普遍采用固相萃取的方法對樣品進行凈化。但固相萃取小柱價格昂貴、操作繁瑣、提取過程不穩(wěn)定。因此，本實驗改進了肉制品中苯并芘的提取方法。先采用皂化的方法除去脂肪，再利用苯并芘易溶于正己烷的性質(zhì)，經(jīng)正己烷結(jié)合超聲處理提取苯并芘，最后用水洗去其他水溶性雜質(zhì)。取空白基質(zhì)(豬肉)各6份，分別加入低(0.005μg/mL)、中(0.02μg/mL)、高(0.05μg/mL)三種不同濃度的苯并芘標準溶液，按照1.2.4的方法對樣品進行提取，同時進行直接測定和過固相萃取柱后測定，計算回收率，結(jié)果見表1。由表1可以看出，過固相萃取柱的回收率低于不過柱的回收率，兩種處理方法的測定結(jié)果之間無顯著性差異(p＞0.05)，因此采用不過固相萃取小柱的方法進行提取。

表3 不同品牌臘肉中苯并芘的含量Table 3 Contents of Bap in preserved ham of different brands

表1 不同凈化方法提取苯并芘的回收率(n=6)Table 1 Recovery of the different method to purifying(n=6)

2.3 標準曲線及線性范圍

取1.2.2節(jié)質(zhì)量濃度0.002～0.5μg/mL的苯并芘系列標準溶液依次從低濃度到高濃度進樣，按2.1節(jié)確定的色譜條件進行測定，每個濃度進行平行測定三次，得出峰面積的平均值，以質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，制作標準曲線(見圖3)，回歸方程為Y=4×108X-662420，相關系數(shù)R2=0.9999。表明在0.002～0.5μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，符合定量要求。

圖3 苯并芘標準曲線Fig.3 Standard curve of Bap

2.4 精密度實驗及方法的檢出限

對質(zhì)量濃度為0.01μg/mL的苯并芘標準溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，所得峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.85%，表明該方法具有良好的精密度。

方法的檢出限(LOD)定義為產(chǎn)生3倍信噪比(S/N=3)的化合物的質(zhì)量濃度，以產(chǎn)生10倍信噪比(S/N=10)的化合物的質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)，選一系列較低濃度的苯并芘標準溶液，按2.1的液相色譜條件進行測定，信噪比S/N=3時，苯并芘的檢出限為0.15μg/kg;信噪比S/N=10時，苯并芘的定量限為0.5μg/kg，實驗結(jié)果表明本方法的靈敏度較高，能滿足對苯并芘檢測和污染控制的要求。

2.5 樣品的加標回收率實驗

準確稱取5g臘肉樣品，分別加入0.01μg/mL的苯并芘標準溶液0.5、2.5、5mL，然后按照1.2.4的方法進行提取，按照2.1的色譜條件進行測定計算加標回收率，測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，加標平均回收率在85.14%～91.01%之間，相對標準偏差在1.96%～5.37%之間，表明該方法的準確度和精密度良好，能夠滿足臘肉中苯并芘含量的檢測要求。

表2 加標回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Results of spike recovery test(n=6)

2.6 實際樣品中苯并芘的測定

從超市里購買了8個品牌的臘肉，按照1.2.4的方法進行提取，按照2.1的色譜條件進行測定，每個樣品取三份，每份平行測定3次，取平均值，所測樣品中苯并芘的含量結(jié)果見表3。利用所建立的方法對市售臘肉中苯并芘含量進行了分析，8種臘肉中均存在著一定量的苯并芘，檢測出的總量在0.98～8.89μg/kg之間。

3 結(jié)論

本實驗建立的高效液相色譜法檢測臘肉中的苯并芘色譜條件為:以Waters X BridgeTMC18反相色譜柱作為分離柱，流動相為甲醇∶水(90∶10)，流速1.0mL/min，柱溫35℃，熒光檢測器激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為410nm，進樣量為10μL，苯并芘的保留時間為11.44min。該方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度均可滿足實際樣品檢測的要求。利用所建立的方法對市售臘肉中苯并芘含量進行了分析，8種臘肉中均存在著一定量的苯并芘，檢測出的總量為0.98～8.89μg/kg之間。本方法對樣品的前處理簡單快速，方法實用、準確，特別適合樣品量較多的實驗，可為今后臘肉中苯并芘研究工作的深入展開提供有力的技術支持。

［1］王欣，周智慧，趙曉聯(lián).苯并(a)芘危害性及其檢測技術［J］.糧食與油脂，2011(3):48-49.

［2］王丹.食品安全隱患-苯并(a)芘的研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(1):132-135.

［3］GARRY S，NESSLANY F，ALIOUAT E，et al.Assessment of genotoxic effect of benzo(α)pyrene in endotracheally treated rat using the comet assay［J］.Mutation Research，2003，534(1-2):33-43.

［4］楊業(yè)鵬，徐厚恩，蘆春林，等.苯并［α］芘對人血淋巴細胞遺傳損傷6項指標的敏感性比較［J］.中華預防醫(yī)學雜志，1994，28(5):275-277.

［5］劉治娟，姬艷麗，吳源，等.苯并［α］芘引起鼠胸腺細胞DNA 損傷及其機制［J］.毒理學雜志，2005，19(4):284-286.

［6］SIMKO P.Determination of polycyclic aromatic hydro-carbons in smoked meat products and smoke flavouring food additives［J］.Journal of Chromatography B，2002，770:3-18.

［7］中國預防醫(yī)學科學院標準處.GB 7104-1994.食品中苯并(a)芘限量衛(wèi)生標準［S］.北京:標準出版社，1995.

［8］劉麗娟.高效液相色譜法測定空氣中苯并(a)芘［J］.山西化工，2007，27(3):38-40.

［9］JANOSZKA B.HPLC-fluorescence analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)in pork meat and its gravy fried without additives and in the presence of onion and garlic［J］.Food Chemistry，2011，126:1344-1353.

［10］FARHADIAN A，JINAP S，ABAS F，et al.Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in grilled meat［J］.Food Control，2010，21:606-610.

［11］CHUNG S Y，YETTELLA R R，KIM J S，et al.Effects of grilling and roasting on the levels of polycyclic aromatic hydrocarbons in beef and pork［J］.Food Chemistry，2011，129:1420-1426.

［12］ISHIZAKI A，SAITO K，HANIOKA N，A.et al.Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in food samples by automated on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with highperformance liquid chromatography-fluorescence detection［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217:5555-5563.

［13］武曉劍，李瓊，費玠，等.高效液相色譜法測定反應香精中的3，4-苯并芘［J］.食品科技，2008(4):192-194.

［14］冼燕萍，郭新東，黃金鳳，等.高效液相色譜-熒光法測定茶葉中苯并［a］芘殘留量的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，24(3):281-289.

［15］黃鸞玉，黎小正，秦振發(fā).固相萃取/高效液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中苯并芘［J］.分析實驗室，2009，28(12):63-66.

［16］黃翠莉，吳蘇喜，王力清，等.油茶籽油中苯并(a)芘的快速檢測方法研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(2):64-66.

［17］弓玉紅，郝林，郭凱凱.萃取-紫外分光光度法測定土壤中3，4-苯并芘含量［J］.山西農(nóng)業(yè)科學，2012，40(4):383-385.

［18］陶順興.食品中苯并(a)芘簡易快速測定方法的研究［J］.食品科學，1995，16(5):48-51.

［19］王煥鎖，王紅勇.雙波長薄層掃描法測定油脂中苯并(a)芘［J］.解放軍預防醫(yī)學雜志，1993，11(6):432-434.

［20］YURCHENKO S，MOLDER U.The determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked fish by gas chromatography mass spectrometry with positive-ion chemical ionization［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2005，18:857-869.