菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

戰(zhàn)榮榮，沐萬(wàn)孟，江 波，周榴明

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

雙果糖酐Ⅲ(DFAⅢ)是一種新型的功能性甜味劑，甜度為蔗糖的52%，卡路里值(0.263kcal/g)卻僅為蔗糖的1/15［1］，其吸濕性低，75%相對(duì)濕度下不吸收任何水分，94%相對(duì)濕度下儲(chǔ)存28d，其吸濕度只有蔗糖的30%［2］，具有取代傳統(tǒng)甜味劑蔗糖的應(yīng)用潛能。在食品、保健、醫(yī)療領(lǐng)域中均具有重要的應(yīng)用價(jià)值［3-5］。然而，DFAⅢ自然界存在極少，化學(xué)方法合成雜質(zhì)多不易分離。菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(inulin fructotransferase，EC 4.2.2.18，IFTase)，是一種可以生物催化廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品菊糖生成DFAⅢ的高效酶。隨著近年來(lái)人們對(duì)天然產(chǎn)品需求的呼聲不斷高漲，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)DFAⅢ受到極大關(guān)注，因此IFTase的研究具有重要的理論及實(shí)際應(yīng)用意義。到目前為止，國(guó)內(nèi)除本實(shí)驗(yàn)室外，對(duì)IFTase的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。而對(duì)該酶的異源表達(dá)研究，國(guó)外也僅實(shí)現(xiàn)Arhthrobacter sp.H65-7、Arthrobacter sp.A-6、A.globiformisC11-1、Arthrobacter sp.、Bacillus sp.Snu-71等5株菌該基因的原核胞內(nèi)表達(dá)［6］，僅A.globiformisC11-1菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在胞外有酶活檢出，且酶活很低(1.5U/mL)［7］。與大腸桿菌相比畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠進(jìn)行蛋白的翻譯后修飾加工，增加酶的穩(wěn)定性［8-9］，也不產(chǎn)生原核表達(dá)過(guò)程中的有害毒素，具有更高的安全性。此外，ift基因在原核表達(dá)中存在信號(hào)肽序列識(shí)別問(wèn)題，這也是該酶異源表達(dá)活性較低的原因之一［10］。因此，真核表達(dá)有望成為 IFTase工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良宿主。本研究以本實(shí)驗(yàn)室已篩選的一株金黃色節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescensSK8.001)為出發(fā)菌株克ift，國(guó)內(nèi)外首次實(shí)現(xiàn)了IFTase在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，可簡(jiǎn)化該酶的后期純化工藝，為DFAⅢ的工業(yè)化酶法生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)，也為功能性甜味劑的開(kāi)發(fā)和研究提供廣闊空間。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

限制酶、T4 DNA連接酶、Premix TaqDNA聚合酶、溶菌酶 TaKaRa公司，引物合成及基因測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成;DNA提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒 上海生工生物工程有限公司;菊糖 比利時(shí)Beneo-Orafti公司;DFAⅢ標(biāo)準(zhǔn)品

日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;其他常規(guī)試劑 進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純;E.coliDH5α和A.aurescensSK8.001菌株 由本實(shí)驗(yàn)室保存;畢赤酵母GS115及表達(dá)載體pPIC9K Invitrogen公司;大腸桿菌培養(yǎng)基(LB)、畢赤酵母培養(yǎng)基 YPD、MD、BMGY、BMMY、YPE-G418 按《Invitrogen公司操作手冊(cè)》方法配制。

表1 ift基因擴(kuò)增及重組酵母PCR鑒定引物Table 1 Primers used in ift gene amplification and PCR identification of recombinant yeast

Agilent1100高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;Authorized Thermal Cycler PCR 儀 德 國(guó)eppendorf;凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio Rad;5904R冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman;SW-CJIFD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限制造公司;梅特勒DEL320pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;721E型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;低溫生化培養(yǎng)箱B1-150A 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ift基因的克隆 以本實(shí)驗(yàn)室篩選的A.aurescensSK8.001菌為出發(fā)菌株，通過(guò)PCR的方法設(shè)計(jì)引物進(jìn)行ift基因擴(kuò)增(不含自身信號(hào)肽序列)，并在基因兩端引入EcoR I及NotI酶切位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性10min，94℃變性1min，60℃退火 1min，72℃延伸 90s，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及高拷貝重組畢赤酵母的篩選 利用EcoR I及NotI對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pPIC9K質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)T4連接酶過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布Ampr抗性LB平板。對(duì)出現(xiàn)的單克隆液體培養(yǎng)提取質(zhì)粒后雙酶切驗(yàn)證，再對(duì)雙酶切陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因測(cè)序，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI中A.aurescensSK8.001菌ift基因比對(duì)確定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pPIC9K-IFTase。將重組質(zhì)粒經(jīng)SacI酶線性化后，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，并涂布MD平板。培養(yǎng)約48h后，挑取出現(xiàn)的單克隆點(diǎn)接于G418-YPD濃度梯度平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，并對(duì)4mg/mL G418-YPD平板單菌落進(jìn)行PCR鑒定以獲得重組酵母菌株，PCR鑒定分別利用通用引物5′AOX及3′AOX作上下游引物，引物序列見(jiàn)表1，并對(duì)PCR鑒定后的陽(yáng)性重組酵母進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 IFTase的誘導(dǎo)表達(dá)及活性驗(yàn)證 將獲得的高拷貝重組畢赤酵母搖瓶水平誘導(dǎo)表達(dá)IFTase，每隔24h添加100%甲醇使其終濃度為1%，每12h取樣進(jìn)行 SDS-PAGE 蛋白檢測(cè)，并按照 Haraguchi［11］等人的測(cè)定方法HPLC法測(cè)定IFTase轉(zhuǎn)化菊糖的活性情況。HPLC檢測(cè)采用Sugarpak1鈣型陽(yáng)離子交換柱;外部柱溫:85℃;流動(dòng)相:純水(經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾);洗脫流速:0.4mL/min;上樣體積:10μL;檢測(cè)器:Shodex示差折光率檢測(cè)器。IFTase的酶活單位定義為:在 60℃、pH8.0的反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1.0μmol/L DFAⅢ所需的IFTase酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ift基因的克隆

以A.aurescensSK8.001為出發(fā)菌株通過(guò)全細(xì)胞PCR擴(kuò)增得到約1200bp的ift基因，如圖1所示。由于在設(shè)計(jì) PCR引物時(shí)，除去了ift基因中信號(hào)肽120bp的編碼序列，因此得到的目的基因片段長(zhǎng)度約為1200bp，小于GenBank(序列號(hào)HM 138085)上發(fā)布的ift基因的序列長(zhǎng)度1353bp。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及高拷貝重組酵母菌株的篩選

將p PIC9K質(zhì)粒及PCR獲得的ift基因雙酶切，以T4連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建pPIC9K-IFTase重組質(zhì)粒，其構(gòu)建過(guò)程如圖2。

圖2 pPIC9K-IFTase重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程圖Fig.2 The restructuring process of pPIC9K-IFTase plasmid

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳在約1200bp及9000bp處出現(xiàn)條帶，與目的基因及p PIC9K的片段大小一致，初步確定獲得pPIC9KIFTase的陽(yáng)性克隆，如圖3。

再經(jīng)基因測(cè)序，利用VectorNT1A11.5軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI中ift基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組載體pPIC9K-IFTase(結(jié)果未給出)。將重組載體p PIC9K-IFTase利用Sac I酶線性化后電轉(zhuǎn)入P.pastorisGS115，經(jīng)MD平板進(jìn)行組氨酸缺陷型初篩，再對(duì)出現(xiàn)的單菌落用含0～4mg/mL濃度梯度的G418-YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行高拷貝重組菌篩選。并于4mg/mL G418-YPD培養(yǎng)基篩選到幾株可能的高拷貝重組酵母。由于通過(guò)G418抗性篩選的菌株易出現(xiàn)假陽(yáng)性，故仍需對(duì)可能的陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR鑒定。利用通用引物5′AOX及3′AOX對(duì)重組菌株進(jìn)行PCR鑒定時(shí)，陽(yáng)性菌株將出現(xiàn)2200bp左右的AOX DNA條帶及1500bp左右的目的基因條帶。這是由于插入表達(dá)載體 pPIC9K的ift基因條帶約1200bp，當(dāng)重組載體整合于GS115基因組后，其結(jié)合的p PIC9K兩端同源臂序列長(zhǎng)度約為300bp，故PCR驗(yàn)證時(shí)的目的基因?qū)⒊蔀榧s1500bp的片段。并對(duì)PCR鑒定的陽(yáng)性重組酵母基因利用通用引物5′AOX及3′AOX測(cè)序并與NCBI中ift基因序列進(jìn)行比對(duì)后表明實(shí)現(xiàn)了ift基因在酵母基因組的整合(結(jié)果未給出)。最終，對(duì)4mg/mL的G418-YPD篩選的菌株經(jīng)PCR鑒定，獲得一株包含ift基因的高拷貝重組酵母菌株，如圖4。

圖3 重組載體pPIC9K-IFTase的雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pPIC9K-IFTase

圖4 重組畢赤酵母PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant P.pastori

2.3 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及活性鑒定

pPIC9K質(zhì)粒為分泌型表達(dá)載體，其構(gòu)建的重組畢赤酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，對(duì)上清經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證顯示，誘導(dǎo)48h后于40.0ku左右出現(xiàn)明顯表達(dá)蛋白，如圖5。這與原始菌株A.aurescensSK8.001表達(dá)的IFTase分子量一致［6］，表明該酵母重組菌可以實(shí)現(xiàn)IFTase酶的分泌表達(dá)，故誘導(dǎo)菌株經(jīng)離心留取上清后即可獲得IFTase粗酶液，可有效簡(jiǎn)化IFTase后期純化工藝，也在一定程度避免了理化操作可能對(duì)酶性質(zhì)產(chǎn)生的影響。

圖5 SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE profiles

為檢測(cè)重組菌分泌的IFTase酶活情況，將不同誘導(dǎo)時(shí)間粗酶液與菊糖溶液在合適條件下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同時(shí)間發(fā)酵上清液IFTase活性及菌體生長(zhǎng)情況，如圖6。60h酶活為10.3U/mL，已超過(guò)國(guó)外唯一胞外表達(dá)菌株A.globiformisC11-1的IFTase活性(胞外酶活1.5U/mL)，表明該株高拷貝重組畢赤酵母能分泌表達(dá)具有相對(duì)較高活性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶。由于外源基因的酶活與畢赤酵母基因組整合的該基因的拷貝數(shù)有關(guān)，IFTase在畢赤酵母中分泌表達(dá)的酶活與整合基因數(shù)的研究正在進(jìn)行中。

圖6 重組畢赤酵母發(fā)酵曲線Fig.6 The curve of enzyme activity of recombinant P.pastoris

3 結(jié)論

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為重組蛋白的分泌表達(dá)載體已被廣泛應(yīng)用［12-13］。目前，來(lái)自該系統(tǒng)的Cephelon制劑已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的。因此，IFTase在酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)具有比原核表達(dá)更高的應(yīng)用安全性。本研究成功實(shí)現(xiàn)了A.aurescensSK8.001菌株的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約40ku，且在畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)48h后發(fā)酵上清液菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)水平明顯升高，60h時(shí)酶活最高，為10.3U/mL。菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的畢赤酵母胞外分泌表達(dá)具有重要的學(xué)術(shù)意義，不僅為該酶真核表達(dá)系統(tǒng)的深入研究奠定基礎(chǔ)，也為利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行基因改造提供理論依據(jù);此外，本研究也為綜合提高我國(guó)酶制劑行業(yè)及相關(guān)產(chǎn)品在各領(lǐng)域更廣闊的發(fā)展提供可能，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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