啤酒固定化連續(xù)后發(fā)酵中兩種載體性能的研究

陳光斌，蔣玉梅，*，李 紅，肖 俠，邵威平，康開萍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027)

固定化酵母技術(shù)應(yīng)用于啤酒連續(xù)后發(fā)酵可以大大減少啤酒后發(fā)酵的時(shí)間，從而降低了生產(chǎn)成本。但同時(shí)也存在諸多問(wèn)題，例如如何對(duì)不同載體的性能進(jìn)行有效的評(píng)價(jià);載體材料成本較高，以至難以在發(fā)酵工業(yè)中推廣等［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外均有學(xué)者使用不同載體對(duì)固定化連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行了研究:程江峰以陶瓷，楊秋明以海藻酸鈉，石小霞等人及李濤等人以海藻酸鈉-聚乙烯醇，陳功等以聚乙烯醇(PVA)與陰離子交換樹脂(苯乙烯型)混合制成的生物膜，Linko等、Kronlof等以山毛櫸木片，Tomas Branyik等以玉米芯作為載體，分別對(duì)固定化技術(shù)以及固定化連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行了研究［2-11］。本文使用價(jià)格低廉的山毛櫸木片和多孔陶瓷作為固定酵母載體，對(duì)這兩種載體在固定化連續(xù)后發(fā)酵中的固定化效果，以及生產(chǎn)的啤酒的各指標(biāo)進(jìn)行比較研究，從而對(duì)固定化載體的性能進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)，并為選出較優(yōu)載體提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Saccharomyces cerevisiae由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院菌種保藏中心提供;山毛櫸木片 其主要參數(shù)約為:長(zhǎng)×寬×高(0.8cm×0.5cm×0.12cm);多孔陶瓷 其主要參數(shù)約為:長(zhǎng)×寬×高(1.0cm×0.8cm×0.6cm);嫩啤酒 10°P麥汁經(jīng)大罐主酵后的發(fā)酵液，要求可發(fā)酵浸出物含量不高于5%，中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院提供。

固定床反應(yīng)罐 反應(yīng)罐帶有夾套，用水制冷，反應(yīng)罐容積為，徑高比為1∶4，自制;UV-2401PC紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;高效液相色譜 日本島津公司;Auto system XL氣相色譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司;HY-5型回旋式振蕩器 上海京工實(shí)業(yè)有限公司;pHS-3C精密pH計(jì) 上海自動(dòng)化儀表公司;HX-105恒溫水浴箱 上海柯維儀器有限公司;HL-ZS恒流泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 分析方法

酵母數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)法;揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定采用氣相色譜自動(dòng)頂空進(jìn)樣;雙乙酰含量測(cè)定采用蒸餾比色法［12］;酒精含量測(cè)定采用蒸餾-比重法;氨基酸測(cè)定采用液相色譜法。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)定兩種載體的固定酵母量 兩種載體經(jīng)沸水蒸煮4h，取出木片然后浸入10%乙醇中2h，取出載體再在沸水中蒸煮 1h［13］。

取20g經(jīng)上述處理后的濕山毛櫸木片(多孔陶瓷)加入250mL三角瓶中，向三角瓶中加入200mL酵母液，酵母液濃度為5×106個(gè)/mL，用封口膜封口，固定吸附條件如下溫度為20℃，搖床轉(zhuǎn)速為80r/min，固定時(shí)間為12h。

在600nm下測(cè)定吸光度［14］，通過(guò)酵母-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出三角瓶液體中的酵母濃度，從而可知載體上酵母數(shù)量。

1.3.2 測(cè)定兩種載體固定化酵母的速率 固定化酵母達(dá)到飽和時(shí)的速率即為載體的固定化酵母的速率，測(cè)定酵母飽和的時(shí)間及飽和時(shí)載體上的酵母數(shù)，測(cè)定酵母數(shù)方法同1.3.1。

1.3.3 測(cè)定兩種載體固定化酵母的牢固程度 傾去三角瓶中剩余的酵母液;用50mL無(wú)菌蒸餾水沖洗載體，載體浸入液面以下持續(xù)10s后，小心傾去液體。重復(fù)操作4次(共沖洗5次);于上述三角瓶中加入100mL無(wú)菌蒸餾水，于搖床中200r/min回旋振蕩，分別測(cè)定振蕩0.5、1、2、3、4min 時(shí)溶液的吸光度。

1.3.4 固定化連續(xù)發(fā)酵操作 進(jìn)行循環(huán)固定化操作。固定化條件如下:時(shí)間為12h，溫度為20℃，設(shè)定線速度為1.7×10-2cm/s。

取主發(fā)酵第5d發(fā)酵液，經(jīng)3000r/min離心10min后，再經(jīng)80℃水浴加熱10min，迅速冷卻至室溫，進(jìn)行固定化發(fā)酵，發(fā)酵在自制反應(yīng)器中進(jìn)行，發(fā)酵條件如下:發(fā)酵溫度10℃，滯留時(shí)間3.1h。

1.3.5 測(cè)定山毛櫸木片和多孔陶瓷作為載體生產(chǎn)的啤酒的各項(xiàng)指標(biāo) 連續(xù)后發(fā)酵完畢后，測(cè)定酒液的重要風(fēng)味物質(zhì)與氨基酸等理化指標(biāo)。

1.3.5.1 樣品預(yù)處理 發(fā)酵液以5000r/min的速度離心10min，取5mL上清液于20mL頂空瓶中，蓋上膠塞，用鋁制瓶塞密封，自動(dòng)進(jìn)樣。

1.3.5.2 色譜條件 色譜柱:DM-WAXETR色譜柱(30m ×0.53mm ×1μm);載氣:氮?dú)?8mL/min);進(jìn)樣口參數(shù):溫度:200℃，分流比5∶1;檢測(cè)器參數(shù):溫度:250℃，氫氣45mL/min;空氣:450mL/min;升溫程序:35℃保溫3min，以10℃/min的速度升溫至60℃保溫0min，20℃/min的速度升至120℃，再以40℃/min的速度升至200℃保溫0min。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

酵母-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 酵母-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Yeast-absorbance standard curve

2.2 兩種載體的固定酵母量的比較

由圖2中可知，兩種載體固定酵母能力差異顯著(p＜0.05)，山毛櫸木片固定化酵母的量比多孔陶瓷固定量高出31.2%。

圖2 兩種載體的固定酵母量Fig.2 The amount of the immobilized yeast by the two carriers

2.3 兩種載體的固定化酵母速率的比較

由圖3中可知，兩種載體固定化酵母速率差異顯著(p＜0.05)，山毛櫸木片固定化酵母達(dá)到飽和時(shí)速率比多孔陶瓷固定化酵母達(dá)到飽和時(shí)速率高45.4%。

圖3 兩種載體在達(dá)到飽和時(shí)固定化酵母的速率Fig.3 The rate of the immobilized yeast by the two carriers when they saturated

2.4 兩種載體固定化酵母的牢固程度的比較

分析圖4可知，初始時(shí)山毛櫸木片上固定酵母的量高于多孔陶瓷上固定酵母的量，隨著時(shí)間的變化，山毛櫸木片與多孔陶瓷上振蕩下來(lái)的酵母量逐漸增多，0～0.5min期間，山毛櫸木片振蕩下來(lái)的酵母量低于多孔陶瓷上振蕩下來(lái)的酵母量;0.5～2min期間，兩種載體上振蕩下來(lái)的酵母量基本持平;而2～4m in期間山毛櫸木片上振蕩下來(lái)的酵母量高于多孔陶瓷上振蕩下來(lái)的酵母量，這是由于多孔陶瓷上的酵母在0～2m in時(shí)大部分均已被振蕩下來(lái)，而2m in時(shí)山毛櫸木片上仍固定著一部分酵母。4m in時(shí)兩載體上固定的酵母完全被振蕩下來(lái)。因此，可知山毛櫸木片固定化酵母的牢固程度優(yōu)于多孔陶瓷。

圖4 山毛櫸木片與多孔陶瓷固定化的酵母的牢固程度Fig.4 The stability of the immobilized yeast by the two carriers

2.5 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵生產(chǎn)的酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)的比較

由表1可知，分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量差異顯著(p＜0.05)，其余指標(biāo)差異不顯著(p＞0.05)。而且以木片為載體生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量，這可能是由于載體木片上酵母量多于多孔陶瓷上的酵母量，從而使其生產(chǎn)的啤酒中更多的雙乙酰被還原。

表1 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵生產(chǎn)的酒的指標(biāo)Table 1 The indexes of the fermented beer by the two carriers

由表2可知，分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中，其乙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇的差異性顯著(p＜0.05)，其余風(fēng)味物質(zhì)的差異不顯著(p＞0.05)。而且以山毛櫸木片為載體生產(chǎn)的啤酒中乙醛含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量。

由表3可知，分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中，酪氨酸、亮氨酸含量差異不顯著(p＞0.05)，其余氨基酸含量差異性顯著(p＜0.05)。

表2 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵啤酒的風(fēng)味物質(zhì)含量(mg/L)Table 2 Flavor substances of the fermented beer by the two carriers(mg/L)

表3 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵啤酒的氨基酸含量(mg/L)Table 3 The content of amino acids of the fermented beer by the two carriers(mg/L)

3 結(jié)論

對(duì)山毛櫸木片和多孔陶瓷兩種載體在固定化連續(xù)后發(fā)酵中固定化酵母的效果以及生產(chǎn)的啤酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行比較和研究。結(jié)果表明:山毛櫸木片的固定化酵母的能力、固定化酵母達(dá)到飽和時(shí)的速率、固定化酵母的牢固程度均優(yōu)于多孔陶瓷。

分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量差異顯著(p＜0.05)，其余指標(biāo)差異不顯著(p＞0.05);而且以山毛櫸木片為載體生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量。風(fēng)味物質(zhì)中，乙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇的差異顯著(p＜0.05)，其余風(fēng)味物質(zhì)的差異不顯著(p＞0.05);而且以山毛櫸木片為載體生產(chǎn)的啤酒中乙醛含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量。氨基酸含量中，酪氨酸、亮氨酸含量差異不顯著(p＞0.05)，其余氨基酸含量差異性顯著(p＜0.05)。

綜合結(jié)果表明，山毛櫸木片固定化酵母能力及其生產(chǎn)的啤酒的品質(zhì)均優(yōu)于多孔陶瓷。

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