利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建梨酒酵母工程菌

張大為，張 潔，洪磊東，金 磊，高 健，梁 芳

(1.湖南科技大學生命科學學院，湖南湘潭411201;2.陜西科技大學生命科學學院，陜西西安710021)

原生質(zhì)體融合(Protoplast Fusion)，即通過酶降解微生物、植物及動物細胞的細胞壁，得到原生質(zhì)體，采用化學、物理或生物學方法將不同屬或?qū)匍g的細胞進行細胞壁內(nèi)的物質(zhì)融合，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生重組，表現(xiàn)出新性狀的一門遺傳育種技術(shù)，稱之為原生質(zhì)體融合［1］。原生質(zhì)體融合技術(shù)是存在于自然界中的一種生物進化方式，人們很早就發(fā)現(xiàn)它的存在，但真正研究開始于上世紀五十年代，從此學者對此項技術(shù)進行了不斷深入的研究，目前出現(xiàn)了很多融合的方法，比如化學融合、激光融合及電融合等常規(guī)方法，廣泛應(yīng)用于遺傳育種領(lǐng)域［2-3］。隨著研究的深入，相繼出現(xiàn)了一些新的融合方法，比如離子束融合技術(shù)、空間融合技術(shù)和非對稱融合技術(shù)等先進可行的方法。在酵母育種范圍內(nèi)主要集中在耐受高底物濃度及酒精度酵母菌種的改造、生料發(fā)酵酵母菌株的選育、耐受高溫釀酒酵母的選育、高絮凝性酵母菌株的選育、降酸及嗜殺性酵母菌株的選育等方面［4］。當前用于梨酒生產(chǎn)的酵母主要是采用葡萄酒酵母或從自然界中分離得到的野生型酵母，這兩種酵母生產(chǎn)出來的酒不能充分體現(xiàn)出梨酒自身的特點，釀造出的酒存在風味較差、出酒率低不具有梨酒典型性等缺點［5］。除此之外，梨酒香氣不足也是影響酒品質(zhì)的重要因素，故構(gòu)建優(yōu)良的梨酒專用酵母成為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)梨酒的前提條件。本研究將前期篩選得到的發(fā)酵性能與產(chǎn)香較好的兩株酵母(Saccharomyces cerevisiaeYDJ05和Issatchenkia orientalisYS03)進行化學融合，期望得到釀造及產(chǎn)香性能優(yōu)良的融合子作為梨酒釀造所用的酵母工程菌，為產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

表1 氨基酸混合液及氨基酸添加濃度Table 1 Mixed amio acids and amino acid concentrarion

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梨 陜西蒲城酥梨;Saccharomyces cerevisiaeYDJ05和Issatchenkia orientalisYS03(前期分離得到，保存于湖南科技大學發(fā)酵工程實驗室)分別作為融合親本X和親本Y;基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基、再生完全培養(yǎng)基、高氮基本培養(yǎng)基、產(chǎn)孢前培養(yǎng)基及產(chǎn)孢培養(yǎng)基，均詳見參考文獻［6］。

BSP-400型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備廠;AUY-120型分析天平 日本島津公司;PB-10型pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SZX10攝影顯微鏡 日本OLYMPUS;MASTER-M型手持折光儀 日本ATGO;HC-2518R型高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原生質(zhì)體融合技術(shù)路線 本實驗原生質(zhì)體融合操作步驟如圖1所示。

圖1 原生質(zhì)體融合步驟示意圖Fig.1 Schematic diagram of the protoplast fusion step

1.2.2 親本菌株Y營養(yǎng)缺陷型遺傳標記的確定采用甲基磺酸乙酯(EMS)法誘變該菌株得到營養(yǎng)缺陷型，再將營養(yǎng)缺陷型菌株傳代培養(yǎng)十次，進一步校驗遺傳標記的穩(wěn)定性，找到遺傳標記穩(wěn)定的突變株。

親本菌株Y的單倍體制備 將菌株Y置于活化后接種在產(chǎn)孢前培養(yǎng)基平板上，放在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，之后接入產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，直至大量孢子形成。用0.9%無菌生理鹽水制得孢子懸液，收集菌體。然后加入2%蝸牛酶液處理菌體(處理條件:33℃水浴4h，然后58℃水浴8min)，待菌液冷卻后加入無菌生理鹽水和液體石蠟制得菌懸液，取0.1mL菌懸液接種于完全培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)直至長出菌落為止，通過顯微鏡鏡檢，不產(chǎn)生子囊孢子的酵母即為單倍體細胞。

單倍體菌株Y的誘變 采用EMS誘變法誘變，具體操作見參考文獻［7-8］。

中間培養(yǎng)和饑餓培養(yǎng) 將經(jīng)過誘變的菌懸液接種于完全培養(yǎng)基(液體)中，28℃培養(yǎng)24h。再次采用上述方法離心收集菌體并洗滌兩次后轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h，進行饑餓培養(yǎng)。

高氮培養(yǎng) 將制得的饑餓菌體培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到高氮源培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3h后加入10μg/mL的制霉菌素，繼續(xù)培養(yǎng)2h，再轉(zhuǎn)入無菌生理鹽水中制成菌懸液備用。

營養(yǎng)缺陷型突變株的檢出 將上述菌懸液稀釋成10-1～10-44個梯度，分別吸取0.2mL原液及稀釋液于完全培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度涂布3個平板，28℃培養(yǎng)4d。選取菌落數(shù)合適的完全培養(yǎng)基平板，采用影印平板法將菌落復制到基本培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2d，對應(yīng)在基本培養(yǎng)基上不能生長的菌落即為營養(yǎng)缺陷型菌株，將營養(yǎng)缺陷型菌株保存于完全培養(yǎng)基斜面上備用。

營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定 從上述斜面上取1環(huán)接種在5mL無菌生理鹽水中，混勻洗滌，采用離心法收集菌體(條件為6000r/min，5min)，再將菌體置于5mL無菌生理鹽水中。將菌懸液0.3mL涂布于基本培養(yǎng)基平板上，放置1min后把蘸取1～6號氨基酸混合液(見表1)的濾紙片放到平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)36h。根據(jù)菌體生長的位置來判斷營養(yǎng)缺陷型種類(見表2)。

表2 缺陷型菌株對營養(yǎng)要求的位置Table 2 Auxotrophic strain and the nutritional requirements position

1.2.3 菌株X和Y原生質(zhì)體制備與再生 原生質(zhì)體制備及酶處理時間的確定:酶解溫度為35℃，詳細操作過程及計算公式參見文獻［9］。

原生質(zhì)體再生:分別將兩親本菌株的原生質(zhì)體1mL與再生完全培養(yǎng)基軟瓊脂(1%瓊脂)4mL混合后取0.1mL倒入再生培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4d，計算菌落數(shù)，即再生細胞數(shù)。計算兩親本菌株的原生質(zhì)體再生率，其公式參照參考文獻［9］。

1.2.4 親本菌株X原生質(zhì)體滅活時間的確定 取1mL菌株X的原生質(zhì)體懸液在60℃的水浴鍋中振蕩處理 6、8、10、12、14min，然后取上述處理液 0.5mL，稀釋適當?shù)谋稊?shù)后涂布于高滲完全培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5d，計算菌數(shù)并計算滅活率，公式見參考文獻［9］。

1.2.5 原生質(zhì)體融合 操作步驟詳見文獻［9］。

1.2.6 融合子的優(yōu)選 將通過遺傳標記篩選出的融合子接種到完全培養(yǎng)基上活化后，分別接種到10mL的帶有杜氏管的試管中，28℃培養(yǎng)，根據(jù)產(chǎn)氣情況、產(chǎn)酒精及產(chǎn)香情況篩選得到最優(yōu)的融合子，作為梨酒的酵母工程菌［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本菌株Y營養(yǎng)缺陷型的篩選結(jié)果

2.1.1 親本菌株Y單倍體與原菌株的形態(tài)比較 親本菌株Y(Issatchenkia orientalisYS03)的原菌株如圖2中a所示，呈橢圓形或近似圓形，生殖方式以出芽生殖為主，少數(shù)出現(xiàn)子囊孢子，是典型的東方伊莎酵母的形態(tài)。單倍體菌株，如圖2的b所示，菌株呈現(xiàn)球形，且個體較原菌株小，從菌落上看也明顯小于原菌株，為下一步的原生質(zhì)體融合做了準備。

圖2 親本菌株Y的原菌株和單倍體菌株的顯微圖片(10×40倍)Fig.2 Parental strain of Y strain and haploid strain in the microscopic picture(10×40)

2.1.2 親本菌株Y突變株的檢出與鑒定 比較在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上且經(jīng)過誘變的菌落生長情況，得到1株的突變株，由圖3看出該突變株只在4號和5號濾紙片上生長，結(jié)合表2可以斷定該突變株是精氨酸缺陷型菌株。將該菌株傳代10次，并在添加精氨酸的基本培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上驗證，發(fā)現(xiàn)該菌株只在添加精氨酸的培養(yǎng)基上生長，從而確定該菌株是具有穩(wěn)定遺傳特性的精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。

2.2 原生質(zhì)體的制備與酶處理時間的確定

2.2.1 親本菌株X和Y的原生質(zhì)體形態(tài) 親本菌株X和Y的原生質(zhì)體形態(tài)如圖4和圖5所示，經(jīng)過蝸牛酶的降解，細胞壁被除去，由于細胞內(nèi)容物失去細胞壁的束縛成為球形。

圖3 親本菌株Y營養(yǎng)缺陷型的檢出結(jié)果Fig.3 Parent strain Y auxotrophic detection results

圖4 親本菌株X的原生質(zhì)體顯微圖片(10×40倍)Fig.4 Photomicrographs of protoplasts of parental strain X(10×40)

圖5 親本菌株Y的原生質(zhì)體顯微圖片(10×40倍)Fig.5 Photomicrographs of protoplasts of parental strain Y(10×40)

2.2.2 酶處理時間的確定 從表3的實驗數(shù)據(jù)可知，隨著酶處理時間的增加，兩株菌的原生質(zhì)體形成率均呈增加趨勢，相對應(yīng)的再生率呈下降趨勢。經(jīng)分析，原因在于:在較恰當?shù)拿笣舛认拢附鈺r間越長，細胞壁的分解越完全，所得的原生質(zhì)體數(shù)量越大，故形成率越大;隨著水解時間的延長，大部分原生質(zhì)已經(jīng)形成，此時酶繼續(xù)發(fā)生作用會破壞已形成的細胞膜，故原生質(zhì)體再生率下降。原生質(zhì)體形成率和再生率直接影響融合的效果及融合子的檢出。本實驗通過不同酶解時間的水解效果，綜合考慮形成率和再生率，得出在35℃條件下最佳酶處理時間:即酶處理時間為100min時，親本菌株X和Y的形成率分別為93.6%和94.2%，相對應(yīng)的原生質(zhì)體再生率分別為27.8%和31.6%。

2.3 親本菌株X原生質(zhì)體滅活時間的確定

單親滅活是原生質(zhì)體融合技術(shù)中常見一種方法，在親本菌株Y制作遺傳標記的前提下，將菌株X進行滅活，滅活的情況直接決定融合的結(jié)果。本實驗采用的滅活方法是熱滅活，主要是通過水浴的方法在60℃條件下，隨著加熱時間的延長使原生質(zhì)體的滅活率逐漸升高。從表4中可以看出，14m in時，原生質(zhì)體可以完全滅活，故在本實驗中原生質(zhì)體X的滅活時間確定為14min。

表3 不同酶處理時間所對應(yīng)親本菌株X和Y的原生質(zhì)體形成率與再生率Table 3 Protoplast formation rate and regeneration rate of the parent strain Y in the different enzyme treatment time

表4 親本菌株X原生質(zhì)體滅活時間的確定結(jié)果Table 4 Time determination results of the parent strain X inactivated protoplasts

2.4 親本菌株X和Y的原生質(zhì)融合

選取親本菌株X和Y等量的原生質(zhì)體，根據(jù)精氨酸缺陷型的遺傳標記篩選融合子菌株，在加入促融劑之后，其融合情況如圖6所示。計算得到融合率為5.8 ×10-5。

圖6 親本菌株X和Y的原生質(zhì)體融合顯微圖(10×40倍)Fig.6 Photomicrographs of the parental strains X and Y protoplast fusion(10×40)

2.5 親本菌株X和Y融合子的優(yōu)選

通過杜氏管發(fā)酵法來考察融合子的產(chǎn)氣情況發(fā)現(xiàn)，在上述融合子中有六株融合子具有良好的產(chǎn)氣能力，其編號分別為DJ01～DJ06。后續(xù)再通過考察六株融合子的產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)香能力及感官指標綜合確定最佳釀造梨酒的融合子作為酵母工程菌。

2.5.1 各融合子產(chǎn)酒精能力的測定 通過考察融合子的產(chǎn)氣情況，初步得到六株發(fā)酵能力較強的融合子，通過進一步的發(fā)酵實驗定時測定其產(chǎn)酒精的能力，結(jié)果如圖7所示。在整個發(fā)酵過程中酒精含量隨著發(fā)酵時間的進行呈逐漸增加的趨勢，但是增加的速度和幅度有較大的區(qū)別，從圖中可以看出DJ02和DJ06的產(chǎn)酒精能力比較強，在發(fā)酵7d時酒精含量分別達到了9.87%和9.74%，均能滿足果酒發(fā)酵的需求。DJ02的酒精濃度增加在第2～6d大部分時間內(nèi)比DJ06要快，到第7d時兩者產(chǎn)酒精速度趨于接近。為了進一步得到最優(yōu)良的酵母工程菌，下面還要對兩種融合子的產(chǎn)香能力進行測定。

圖7 融合子DJ01～DJ06產(chǎn)酒精能力的測定結(jié)果Fig.7 Determination results of the fusions DJ01～DJ06 alcohol producing ablility

2.5.2 融合子DJ02和DJ06產(chǎn)香情況的測定 為了進一步確定最適合釀造梨酒的融合子，定時測定發(fā)酵酒樣的總酯產(chǎn)生能力，從圖8中可知隨著時間的增加總酯含量呈現(xiàn)增加的趨勢，到第7d達到高峰期。其中，DJ02的產(chǎn)總酯能力較DJ06要強，融合子DJ02在第7d達到高峰期為0.37g/L。

通過考察融合子菌株的產(chǎn)氣能力、產(chǎn)酒精能力以及產(chǎn)香能力，發(fā)現(xiàn)融合子DJ02都是最優(yōu)的，故確定融合子DJ02為梨酒釀造所用的酵母工程菌。

圖8 融合子DJ02和DJ06產(chǎn)香能力的測定結(jié)果Fig.8 Determination results of the fusions DJ02 and DJ06 aroma-producing capability

3 結(jié)論

本研究以EMS誘變法誘變親本菌株Y得到了一株精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，以此作為遺傳標記，通過單親滅活法將親本菌株X和Y進行融合。菌株X和Y的原生質(zhì)體形成率分別為93.6%和94.2%，再生率分別為27.8%和31.6%，菌株X和Y的融合率為5.8×10-5。得到產(chǎn)酒、產(chǎn)香能力均較強的融合子DJ02，分別達到9.87%(v/v)和0.37g/L。

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