幾種常見果蔬抗氧化活性與多酚和維生素C的關(guān)系

米書梅，阮 征，溫艷梅，周 艷，張 翠，劉文群，印遇龍，3，江 波，*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031;3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長沙410125)

水果和蔬菜是人類的主要食物來源之一，它們不僅提供維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等營養(yǎng)成分，而且近年來研究表明攝食水果蔬菜還能夠預(yù)防退行性疾病尤其是心血管疾病、癌癥等發(fā)生［1］。這歸功于其中存在的多種功能性物質(zhì)，如酚類化合物、類胡蘿卜素、纖維素等，其中酚類物質(zhì)尤其重要，其抗氧化效果甚至強(qiáng)于眾所周知的維生素C(Vitamin C，VC)、維生素E、β-胡蘿卜素等［2］。了解果蔬的抗氧化活性對(duì)于人們能合理利用營養(yǎng)物質(zhì)，研制預(yù)防癌癥等老年疾病的功能食品非常重要［3］。Eberhart等［4］證實(shí)水果和蔬菜中植物性化學(xué)物質(zhì)的綜合作用是它們強(qiáng)大的抗氧化功能和抗癌活性的關(guān)鍵，比單獨(dú)提取的抗氧化成分效果更佳。近年研究表明，對(duì)食物整體抗氧化能力的認(rèn)識(shí)不足，忽略了食物中各種成分的相互作用及其對(duì)抗氧化能力的影響［5］。果蔬中抗氧化活性物質(zhì)種類多樣，包括維生素，多酚以及黃酮等［6］，國內(nèi)外對(duì)果蔬抗氧化能力與活性物質(zhì)進(jìn)行了大量的研究。張傳玉等［7］研究了不同品種的水稻中VC的含量以及VC與水稻的抗氧化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VC含量與水稻抗氧化作用可能存在密切的聯(lián)系，并進(jìn)一步證實(shí)VC在水稻的抗氧化脅迫中的重要作用。陳偉等［8］研究發(fā)現(xiàn)蔬菜、水果的抗氧化活性與總黃酮含量具有一定的相關(guān)性，但不同種類的蔬菜和水果，相關(guān)性有一定的差異。Padilla FC等［9］研究了一些種子、堅(jiān)果和谷物食品的多酚含量以及抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)多酚含量與抗氧化活性有一定的相關(guān)性。陳金娥等［10］用鉬酸銨分光光度法測(cè)定10種蔬菜中VC的含量，用DPPH法對(duì)比研究生熟蔬菜的抗氧化性，證實(shí)VC含量與其抗氧化性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。因此，由以上研究結(jié)果可以看出，對(duì)果蔬抗氧化的研究主要集中在某一類活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性，然而不同的活性成分對(duì)果蔬整體抗氧化能力的影響各不相同，在同一體系中對(duì)不同活性成分與抗氧化活性相關(guān)性的認(rèn)識(shí)不足。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用常見的五種抗氧化測(cè)定方法對(duì)我國常見的10種果蔬的抗氧化活性進(jìn)行比較;運(yùn)用Folin-Ciocalteus法和2，4-二硝基苯肼法測(cè)定果蔬中多酚類、VC含量，并且分析、比較了抗氧化活性與多酚類化合物和VC含量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷心菜、胡蘿卜、洋蔥、茄子、豆角、橘子、香蕉、蘋果、葡萄、西瓜 于8月份購自南昌市天虹超市;羥自由基、超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供;DPPH(1，1-二苯-2-苦肼基)、ABTS［2，2-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯噻唑-6-磺酸)］、TPTZ(三吡啶三吖嗪)、沒食子酸標(biāo)品 美國Sigma-Aidrich公司;VC廣州鑫昌生物科技有限公司;濃硫酸、濃磷酸、無水乙醇、氯化鐵、鎢酸鈉、鉬酸鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、草酸、硫脲、冰乙酸等 國產(chǎn)分析純。

SC-3614臺(tái)式離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;AL104分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;722E可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇城西曉陽電子儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與處理 所有樣品均用自來水、蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，取日常食用部位若干克，切碎后按1∶9比例(質(zhì)量體積比)加入蒸餾水搗碎。去果蔬組織勻漿液于4800r/min離心15min，上清液分別測(cè)定果蔬水提液。果蔬水提液分別測(cè)定抗氧化活性、VC、總酚含量，如果樣品濃度過高，適當(dāng)稀釋，平行測(cè)定3次。

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 DPPH法 參考Mezadri等的方法［11］稍做調(diào)整。DPPH工作液:準(zhǔn)確稱取25mg DPPH，溶解于500mL無水乙醇中，置于棕色瓶中，在4℃避光保存。吸取待測(cè)樣品0.5mL，加入2.5mL DPPH工作液，漩渦振蕩混勻，避光37℃水浴30min，在517nm下測(cè)吸光度。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.0471x+0.7904(R2=0.9995)，樣品抗氧化活性以AEAC/100g(每100g物質(zhì)的抗氧化能力相當(dāng)于VC(mg)的抗氧化能力)表示。

1.2.2.2 ABTS法 參考 Biglar和 Easa的方法［12］稍做調(diào)整。ABTS工作液:10mL 0.22mmol/L ABTS，10mL 0.2623mmol/L過硫酸鉀，混合避光過夜，制取ABTS自由基。使用時(shí)用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋40倍。取0.5mL待測(cè)樣品，加入2.5mL ABTS工作液，漩渦振蕩混勻，避光37℃水浴30min，在746nm下測(cè)吸光度。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.0418x+0.9961(R2=0.9994)，樣品抗氧化活性以AEAC/100g(每100g物質(zhì)的抗氧化能力相當(dāng)于VC(mg)的抗氧化能力)表示。

1.2.2.3 FRAP法 參考Benzie和Strain的方法［13］稍做調(diào)整。FRAP工作液:由0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL 10mmol/L TPTZ 溶液 2.5mL，20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成。取0.5mL某待測(cè)樣品，加入2.5mL FRAP工作液混勻后37℃反應(yīng)30min，593nm測(cè)定吸光度，以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0084x+0.0169(R2=1)，樣品抗氧化活性以AEAC/100g(每100g物質(zhì)的抗氧化能力相當(dāng)于VC(mg)的抗氧化能力)表示。

1.2.2.4 清除超氧陰離子自由基 采用南京建成生物工程研究所清除羥自由基測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

抑制超氧陰離子自由基能力(U/L)=(對(duì)照管OD-測(cè)定管OD)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.15mg/mL)×1000mL/(取樣量×稀釋倍數(shù))

1.2.2.5 清除羥自由基 采用南京建成生物工程研究所清除羥自由基測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

抑制羥自由基能力(U/L)=(對(duì)照管OD-測(cè)定管OD)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管 OD)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(8.824mmol/L)×1000mL/(取樣量×稀釋倍數(shù))

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法測(cè)果蔬中的多酚，參考Hao Zhang等的方法［14］稍做調(diào)整。吸取1mL待測(cè)樣品，加入Folin-Ciocalteu顯色劑1mL放置5min后，加入10%碳酸鈉溶液3mL，1min后用蒸餾水定容到10mL。37℃水浴30min后，在764nm波長下測(cè)定樣品的吸光度，同時(shí)以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0186x+0.022(R2=0.9996)，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)與吸光度值(A)計(jì)算多酚含量。

1.2.4 VC含量的測(cè)定 依照 GB/T 5009.86-2003［15］主要步驟:取適量樣品加等量2%草酸溶液勻漿，取勻漿液用1%草酸溶液定容至100mL混勻過濾。濾液中加入活性炭，用力振搖1min，過濾即得樣品氧化液。加等量2%硫脲溶液，混勻得到樣品濾液。加入二硝基苯肼和85%硫酸形成橘紅色化合物之后，測(cè)定其在490nm下的吸光度。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5274x+0.0142(R2=0.9999)。

表1 蔬菜、水果提取液的抗氧化評(píng)價(jià)Table 1 Antioxidant activities of the extract of vegetables and fruits

表2 五種方法相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of fivemethods

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 果蔬抗氧化活性測(cè)定及相關(guān)分析

由表1可知，DPPH法抗氧化能力從高到低依次為豆角＞橘子＞洋蔥＞蘋果＞香蕉＞葡萄＞茄子＞卷心菜＞胡蘿卜＞西瓜;ABTS法抗氧化能力從高到低依次為豆角＞洋蔥＞橘子＞香蕉＞茄子＞蘋果＞葡萄＞卷心菜＞胡蘿卜＞西瓜;FRAP法抗氧化能力從高到低依次為橘子＞豆角＞洋蔥＞葡萄＞蘋果＞卷心菜＞香蕉＞茄子＞胡蘿卜＞西瓜。超氧陰離子自由基的測(cè)定結(jié)果差異極大，香蕉最強(qiáng)為2855.01U/L，胡蘿卜的清除能力最弱為11.15 U/L，兩者相差258倍。橘子清除羥自由基能力最強(qiáng)8553.03U/L，卷心菜清除能力為1333.59U/L。

5種方法所采用的試劑不同，作用底物也不同。因此為得到適合評(píng)價(jià)果蔬抗氧化能力的方法，我們還需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析。采用SPSS分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。DPPH、ABTS和FRAP的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)都在0.7103以上，其中，DPPH法和 ABTS法的相關(guān)性最好，相關(guān)系數(shù)為0.9315。超氧陰離子自由基和羥自由基與其他方法相關(guān)性都很差，DPPH、ABTS和FRAP與羥自由基和超氧陰離子自由基的相關(guān)系數(shù)都在0.4521以下。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是由于反應(yīng)機(jī)理不同。DPPH、ABTS是基于單電子轉(zhuǎn)移(SET)反應(yīng)機(jī)制的抗氧化評(píng)價(jià)方法，能夠反映體外清除自由基的能力［16］;而FRAP是通過氧化還原能力來反映物質(zhì)總抗氧化的活性;且這三種方法操作簡易，重現(xiàn)性好。羥自由基和超氧陰離子法能直觀反映抗氧化活性物質(zhì)對(duì)體內(nèi)自由基的清除能力，但步驟較為繁瑣，且重現(xiàn)性差，不適合天然產(chǎn)物抗氧化活性的批量測(cè)定。綜上所述，DPPH、ABTS、FRAP較為適合評(píng)價(jià)果蔬抗氧化能力。

2.2 蔬菜、水果中的總酚和VC含量

由表3可以看出:洋蔥的總酚含量最高，GAE為35.98mg/100g，而西瓜的總酚含量最低，僅為5.87mg/100g，最高與最低之間相差6.13倍。橘子的VC含量最高，為31.06mg/100g，而茄子的 VC含量最低，為4.15mg/100g，最高與最低之間相差7.48倍。陳玉霞等［17］測(cè)定常見的 25種蔬菜的總酚含量，藕最高(305mg/100g)，芹菜最低(10.97mg/100g);VC含量，甜椒最高(90mg/kg)，茄子最低(1.0mg/kg)。方敏等［18］對(duì)15種水果和33蔬菜VC含量進(jìn)行測(cè)定，紅辣椒、青椒和苦瓜含量最高;胡蘿卜、蘑菇最低。本研究與上述結(jié)果有一定差異，原因可能是果蔬的品種、產(chǎn)地不同，保存時(shí)間不同;還可能是采用的測(cè)定方法有所差別。

2.3 果蔬總抗氧化活性與多酚和VC的相關(guān)性

經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)、回歸分析，結(jié)果見表4。由相關(guān)系數(shù)(R)可以看出DPPH、ABTS法測(cè)得的總抗氧化活性與多酚含量間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.884、0.848，而FRAP法測(cè)得的總抗氧化活性與多酚含量相關(guān)性相對(duì)較差，相關(guān)系數(shù)為0.547?？赡茉?FRAP法原理與DPPH、ABTS法不同而引起的差異，從表2五種方法相關(guān)性分析里也可以看出，F(xiàn)RAP法與 ABTS、DPPH法相關(guān)性不如DPPH法與ABTS法的相關(guān)性好。三種方法測(cè)得的總抗氧化活性與VC含量的相關(guān)性都較弱，而由回歸系數(shù)(R2)可以看出多酚含量的增加要比VC含量增加引起果蔬總抗氧化活性增加要大，由此可見，果蔬中的多酚比VC對(duì)果蔬抗氧化活性的影響要大。

表3 蔬菜、水果中的總酚和VC含量Table3 PhenolicsandVitaminCofvegetablesandfruits

表4 果蔬總抗氧化活性與多酚和VC的相關(guān)性Table4 Correlationanalysisofantioxidantacticityoffruits andvegetablesandphenolicsandVitaminC

郭長江等［19］人認(rèn)為大多數(shù)蔬菜的抗氧化活性來源于VC以外的抗氧化成分。Maisuthisakul等人認(rèn)為植物體內(nèi)的抗氧化活性主要是由酚類物質(zhì)提供的，酚類物質(zhì)與抗氧化活性直接相關(guān)［20］。我們的研究結(jié)果也表明:果蔬的抗氧化活性與多酚之間存在著很強(qiáng)的相關(guān)性，而與VC之間的相關(guān)性較弱，說明這些果蔬的抗氧化活性主要由多酚提供。同時(shí)VC與多酚之間的相關(guān)性也較弱，說明果蔬中多酚的含量與VC的含量之間沒有很大的關(guān)系。

3 結(jié)論

由于果蔬抗氧化物質(zhì)的多樣性，在評(píng)價(jià)果蔬抗氧化能力時(shí)需采用多種方法進(jìn)行綜合評(píng)定。通過DPPH、ABTS以及FRAP這三種方法檢測(cè)果蔬抗氧化活性，并與多酚和VC含量進(jìn)行相關(guān)性分析，其結(jié)果可以看出果蔬的抗氧化活性與多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的相關(guān)性，與VC之間的相關(guān)性較弱，說明多酚對(duì)果蔬抗氧化能力的影響強(qiáng)于VC。由于食物整體的復(fù)雜性，活性物質(zhì)的多樣且含量不一，全部檢測(cè)很不現(xiàn)實(shí)，加之物質(zhì)-物質(zhì)相互作用也將影響到抗氧化能力，因此找出影響食物整體抗氧化能力的主要物質(zhì)很有必要。該文比較了多酚和VC對(duì)果蔬抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)多酚較之VC對(duì)果蔬抗氧化作用大。本研究為進(jìn)一步探討對(duì)果蔬抗氧化能力起決定性作用的主要物質(zhì)，以及進(jìn)一步研究其他活性成分與主要物質(zhì)的相互作用對(duì)抗氧化能力的影響打下基礎(chǔ)。

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