不同品種蜂花粉總黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性的研究

陳南迪，方妙玉，吳錫鴻，段倩倩，林 勵(lì)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

蜂花粉為蜜蜂采集的有花植物的雄性生殖細(xì)胞［1］，主要成分為蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、維生素、多種常量和微量元素、黃酮類物質(zhì)等［2-3］，因富含黃酮類化合物，常具有抗疲勞、增強(qiáng)體力、增強(qiáng)記憶力等作用［4］。目前蜂花粉總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究的報(bào)道較多，冉林武［5］等通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲波法提取枸杞蜂花粉黃酮化合物;張紅城［6］等對(duì)6種蜂花粉進(jìn)行了多酚和黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定及抗氧化活性研究，報(bào)道蜂花粉具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力以及還原能力。蜂花粉的品種不同，其所含成分、抗氧化能力有一定的差異，黃酮類成分已被認(rèn)為是蜂花粉抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［7］。目前常用抗氧化活性實(shí)驗(yàn)方法有高錳酸鉀氧化法、磷鉬酸法、DPPH自由基清除測(cè)定法、羥基自由基清除率測(cè)定法等，其機(jī)制均不相同，闡明總黃酮含量與不同機(jī)制抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性，就可能逐步揭示蜂花粉抗氧化作用的機(jī)制。為此，本研究以18種蜂花粉為材料，測(cè)定其總黃酮含量，并對(duì)總黃酮與不同機(jī)制抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為蜂花粉抗氧化作用機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂花粉 食品級(jí)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定為蜂花粉，65℃恒溫烘干磨成細(xì)粉，過(guò)80目篩，置于干燥器中備用，采集樣品見(jiàn)表1;蘆丁對(duì)照品 國(guó)家藥檢所08-9715;2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH，純度96%)Sigma公司;高錳酸鉀、磷鉬酸、硫酸、草酸鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

BP211D型電子分析天平德國(guó)Sartorius公司，感量0.01mg;8453E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)Agilent;KQ-500型超聲儀(40kHz，500W)昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂花粉總黃酮含量的測(cè)定

表1 樣品編號(hào)Table 1 Sample list

1.2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品5mg，置于25mL量瓶，以74%乙醇定容至刻度，制成濃度為0.200mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取備用蜂花粉粉末約1.000g，置具塞錐形瓶中，加74%乙醇39mL，超聲提取(500W，25℃)45min，抽濾，以74%乙醇定容至50mL作為待測(cè)液。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密移取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5、6mL 于 25mL 量瓶，加入 5% 的 NaNO21mL，搖勻，6min后加入10%的Al(NO3)31mL，搖勻，6min后再加入4%的NaOH 10mL，以74%乙醇定容至刻度，搖勻。5min后，在510nm測(cè)定吸光度A，計(jì)算得蘆丁濃度Y(mg/mL)與吸光度A的回歸方程，根據(jù)回歸方程可計(jì)算蜂花粉總黃酮含量。

1.2.1.4 方法學(xué)考察 對(duì)其重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率進(jìn)行方法學(xué)考察。

精密度考察:精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3mL，置于25mL容量瓶中，采用AlCl3顯色法測(cè)定。先加入5%的NaNO21mL，搖勻，放置6min后加入10%的Al(NO3)31mL，搖勻，放置6min后再加入4%的NaOH 10mL搖勻，用74%乙醇稀釋至刻度，在510nm測(cè)定吸光度。連續(xù)測(cè)定5次，記錄結(jié)果。

穩(wěn)定性考察:精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3mL，按照“精密度考察”項(xiàng)下方法測(cè)定，30min內(nèi)每隔5min進(jìn)行一次測(cè)定，記錄結(jié)果。

重復(fù)性考察:精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，按照“精密度考察”項(xiàng)下方法測(cè)定，然后分別記錄其吸光度。

回收率實(shí)驗(yàn):精密移取6份供試品溶液3mL于25mL量瓶，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6mg，加入5%的NaNO21mL，搖勻，6min后加入 10%的Al(NO3)31mL，搖勻，6min后再加入 4% 的 NaOH 10mL，以74%乙醇定容至刻度，搖勻。5min后，在510nm測(cè)定吸光度A。

1.2.1.5 總黃酮含量測(cè)定 精密移取供試品溶液3mL于25mL量瓶，加入 5%的 NaNO21mL，搖勻，6min后加入10%的Al(NO3)31mL，搖勻，6min后再加入4%的NaOH 10mL，以74%乙醇定容至刻度，搖勻。5min后，在510nm測(cè)定吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按公式計(jì)算提取液中總黃酮的濃度。蜂花粉總黃酮含量公式見(jiàn)式1。

蜂花粉總黃酮含量(mg/g)=(提取液濃度×體積×稀釋倍數(shù))/樣品質(zhì)量 式(1)

1.2.2 不同品種蜂花粉抗氧化性評(píng)價(jià) 蜂花粉總黃酮含量測(cè)定提取液同時(shí)作為抗氧化樣品試液，分別采用高錳酸鉀氧化時(shí)間測(cè)定法［8］、磷鉬酸法［9］、DPPH自由基清除法［10］、羥基自由基清除法［11］評(píng)價(jià)各個(gè)品種蜂花粉的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均平行進(jìn)行3次。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化，并根據(jù)抗氧化實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件及穩(wěn)定性，確定四種抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重分別:高錳酸鉀氧化時(shí)間測(cè)定結(jié)果(X1)為130%，磷鉬酸結(jié)合強(qiáng)度(X2)為110%，羥基自由基清除率(X3)為90%，DPPH自由基清除率(X4)為70%。依公式2得到蜂花粉抗氧化活性總指標(biāo)(Y)，排序得18種蜂花粉的抗氧化活性強(qiáng)弱順序。

1.2.2.1 高錳酸鉀氧化法 依中國(guó)藥典高錳酸鉀氧化法進(jìn)行，精密量取樣品液1mL及蒸餾水9mL，置于錐形瓶中，精密加入20%硫酸溶液2mL，振搖1min，精密加入0.02mol/L高錳酸鉀溶液0.05mL，記錄溶液紅色完全消失時(shí)間，即為樣品液的氧化時(shí)間。根據(jù)氧化時(shí)間的長(zhǎng)短評(píng)價(jià)其抗氧化活性。

1.2.2.2 磷鉬酸法 精密量取樣品液1mL、硫酸溶液1mL、磷鉬酸溶液1mL置于5mL量瓶中，蒸餾水定容至刻度。95℃恒溫水浴30min，取出放至室溫后，測(cè)其在619nm波長(zhǎng)處的吸光度。根據(jù)抗氧化活性物質(zhì)與磷鉬酸的結(jié)合強(qiáng)度評(píng)價(jià)其抗氧化活性強(qiáng)弱。磷鉬酸結(jié)合強(qiáng)度計(jì)算公式見(jiàn)式3。

1.2.2.3 DPPH自由基清除測(cè)定法 精密稱取0.015g DPPH置于250mL量瓶中，以95%乙醇定容至刻度。精密量取1mL樣品液置10mL量瓶中，蒸餾水定容。精密移取樣品液1mL、DPPH溶液5mL于試管中，避光保存待測(cè)，1h后測(cè)定其在515nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算清除率。

1.2.2.4 羥基自由基清除率測(cè)定法 精確移取0.5mL 18mmol/L鄰二氮菲溶液置于10mL量瓶中，再加入2.0mL pH7.4的 PBS溶液，混勻后加入 1.0mL 7.5mmol/L的 FeSO4溶液，充分混勻后加入1.0mL 0.2%H2O2溶液，蒸餾水定容，37℃下反應(yīng)30min，測(cè)其在510nm波長(zhǎng)處吸光度A1。同上法，加樣品液后再加H2O21.0mL，測(cè)得A2;同上法，不加H2O2和樣品液測(cè)得A3。

1.2.3 蜂花粉總黃酮含量與抗氧化性的相關(guān)系數(shù)采用EXCEL分別計(jì)算不同品種蜂花粉總黃酮含量與四種抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在510nm處測(cè)得各吸光度值，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到蘆丁濃度與吸光度Y關(guān)系曲線的回歸方程:

Y=12.07X+0.002，R=0.9990。

2.1.2 方法學(xué)考察 精密度考察實(shí)驗(yàn)RSD值為0.47%;重復(fù)性考察實(shí)驗(yàn)RSD為0.81%;顯色結(jié)果1h內(nèi)穩(wěn)定;樣品加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，平均加樣回收率結(jié)果為99.80%，RSD值為0.80%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所用方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于蜂花粉總黃酮的含量測(cè)定。

表2 樣品加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Recovery results of samples(n=6)

表3 不同品種蜂花粉總黃酮含量及抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(，n=3)Table 3 The result of total flavonoids and antioxidant activity(，n=3)

表3 不同品種蜂花粉總黃酮含量及抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(，n=3)Table 3 The result of total flavonoids and antioxidant activity(，n=3)

樣品編號(hào) 總黃酮含量(mg/g)高錳酸鉀褪色時(shí)間(s)磷鉬酸結(jié)合強(qiáng)度(%)DPPH自由基清除率(%)羥基自由基清除率(%) 總指標(biāo)(%)40 68.58±0.25 62.39 2 14.306±0.026 4.77±0.22 57.25±6.31 73.40±3.48 71.15±5.46 65.81 3 9.302±0.240 4.89±0.18 48.06±8.59 74.42±0.61 54.68±2.45 61.69 4 3.470±0.042 11.40±0.29 55.45±4.11 34.00±5.64 66.47±0.46 46.96 5 6.711±0.021 25.03±1.24 34.11±8.50 21.76±2.65 54.39±4.05 10.03 6 5.273±0.009 7.42±0.51 74.36±6.39 31.40±2.95 77.86±5.46 63.18 7 6.294±0.074 7.80±0.43 36.69±5.06 22.33±6.74 72.64±3.98 48.19 8 10.860±0.018 6.12±0.42 103.22±21.65 51.71±9.67 72.33±9.73 74.94 9 7.261±0.016 22.67±0.63 57.56±10.84 25.67±10.89 43.32±6.69 13.46 10 4.974±0.021 14.64±1.07 38.15±6.65 29.70±2.61 51.58±5.60 27.82 11 12.546±0.031 6.50±0.33 53.89±8.15 61.36±1.60 68.62±6.21 64.52 12 4.289±0.022 4.60±0.46 144.03±23.35 30.21±3.54 76.94±2.87 81.84 13 6.496±0.018 3.86±0.16 72.26±8.14 40.29±3.05 73.35±5.09 68.44 14 5.445±0.024 7.14±0.33 18.64±5.51 31.69±6.68 77.28±10.04 51.14 15 8.462±0.025 7.48±0.42 88.51±9.37 30.86±7.67 69.14±15.25 60.78 16 12.166±0.017 5.06±0.47 49.23±7.26 54.47±2.31 54.20±0.52 54.76 17 4.049±0.055 21.37±0.85 23.08±1.33 32.76±3.10 80.82±7.37 32.75 18 10.892±0.031 4.92±0.30 73.39±9.71 73.71±1 7.495±0.010 7.76±0.67 75.86±1.00 46.34±5.3.70 52.46±1.12 65.63

2.1.3 不同品種蜂花粉總黃酮含量 由表3可得，不同品種蜂花粉總黃酮含量為3.470～14.306mg/g。其中油菜蜂花粉總黃酮含量最高，其余依次為棗花、沙棗、五倍子、益母草蜂花粉等，一枝黃花蜂花粉總黃酮含量最低。

2.2 不同品種蜂花粉抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，高錳酸鉀氧化時(shí)間法以數(shù)值低者為抗氧化活性較強(qiáng)者，其他三種方法均為數(shù)值高者抗氧化活性較強(qiáng)者。高錳酸鉀氧化法為藥典收錄方法，重復(fù)性高穩(wěn)定性強(qiáng)，作為判定第一因素;磷鉬酸法操作簡(jiǎn)便，影響因素較少較穩(wěn)定，作為判定第二因素;羥基自由基清除率測(cè)定法存在一定不穩(wěn)定因素，作為判定第三因素;DPPH自由基清除法易受光因素的影響，作為判定的第四因素。

表3顯示，不同品種蜂花粉具有較強(qiáng)的抗氧化活性以及較強(qiáng)的自由基清除能力，但是不同品種之間存在較明顯的差異。根據(jù)四種不同判定因素以及歸一化的抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)18個(gè)不同品種蜂花粉的抗氧化活性強(qiáng)弱進(jìn)行排序，其強(qiáng)弱順序:玫瑰＞益母草＞虞美人＞油菜＞五倍子＞棗花＞獼猴桃＞桃花＞五味子＞蘋(píng)果＞沙棗＞玉米＞茶花＞一枝黃花＞蕎麥＞菊花＞葵花＞荷花。

2.3 蜂花粉總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)

由表4可見(jiàn)，蜂花粉中總黃酮含量與高錳酸鉀褪色時(shí)間及羥基自由基清除率呈負(fù)相關(guān)，與磷鉬酸結(jié)合強(qiáng)度及DPPH自由基清除率為正相關(guān);但高錳酸鉀褪色時(shí)間與其他三種抗氧化活性均呈負(fù)相關(guān)。蜂花粉總黃酮含量與DPPH自由基清除率相關(guān)系數(shù)最大為0.7780。張紅城［6］等通過(guò)對(duì)6種蜂花粉進(jìn)行DPPH自由基清除能力以及還原力的實(shí)驗(yàn)研究，也發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)對(duì)自由基引起的連鎖起始反應(yīng)階段的抑制作用較好;程妮［12］等通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地油菜蜂花粉抗氧化活性的研究，同樣證實(shí)在油菜蜂花粉提取物中，黃酮類物質(zhì)為主要的自由基清除劑。此外，蜂花粉中成分復(fù)雜多樣，孫麗萍［13-14］、Campos［15］等報(bào)道蜂花粉中黃酮類、多酚類、脂類(類胡蘿卜素)、維生素C、維生素E均具有一定的抗氧化活性。這些成分之間可能存在協(xié)同作用，影響抗氧化效果。蜂花粉總黃酮含量與羥基自由基清除率為負(fù)相關(guān)，可能受多酚、脂類等物質(zhì)影響所致;有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

表4 總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)Table 4 The correlation coefficient of total flavonoids and antioxidant activity

3 結(jié)論

蜂花粉具有優(yōu)良的抗氧化能力，為天然的抗氧化劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:18種蜂花粉總黃酮含量為3.470～14.306mg/g，且均具有一定的抗氧化活性。不同品種蜂花粉具抗氧化活性能力有顯著差異，其抗氧化活性強(qiáng)弱順序:玫瑰＞益母草＞虞美人＞油菜＞五倍子＞棗花＞獼猴桃＞桃花＞五味子＞蘋(píng)果＞沙棗＞玉米＞茶花＞一枝黃花＞蕎麥＞菊花＞葵花＞荷花。

蜂花粉總黃酮含量與不同機(jī)制的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性不同，蜂花粉總黃酮含量與DPPH自由基清除率相關(guān)性最強(qiáng)，表明總黃酮可能是蜂花粉清除DPPH自由基的主要活性成分之一。

［1］李雅晶，胡福良，馮磊.蜂花粉抗氧化的機(jī)理與應(yīng)用［J］.蜜蜂雜志，2005(3):9-11.

［2］張雨，李艷芳，周才瓊.花粉主要營(yíng)養(yǎng)成分與保健功能［J］.中國(guó)蜂業(yè)，2006，57(7):26-27.

［3］蘇壽祁.蜂花粉的化學(xué)組成［J］.中國(guó)養(yǎng)蜂，2005，56(9):42-43.

［4］Ting Lu，Edward PC Lai，Jorn CC Yu，et al.Analysis for flavonoids in bee pollens by capillary electrophoresis［J］.Food Science，2006，325:582-587.

［5］冉林武，閆亞美，曹有龍，等.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲波法提取枸杞蜂花粉黃酮類化合物工藝［J］.食品科學(xué)，2012(12):37-40.

［6］張紅城，董捷，李慧，等.六種蜂花粉多酚和黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定及抗氧化性的研究［J］.食品科學(xué)，2007(9):500-504.

［7］劉光南，賴由運(yùn)，劉振水，等.蜂花粉抗氧化作用的研究進(jìn)展［J］.蜜蜂雜志，2011(11):34-36.

［8］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)［S］.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2010:336.

［9］李軍.鉬藍(lán)比色法測(cè)定還原型維生素 C［J］.食品科學(xué)，2000(8):42-45.

［10］彭長(zhǎng)連，陳少薇，林植芳，等.用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)植物抗氧化能力［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，35(1):209-212.

［11］Li LL，Cao GQ，Zeng LL，et al.Free radical scavenging effects from Sanguisorba Officinalis［J］.Nat Prod Res Dev，2008，20:511-513.

［12］程妮，王畢妮，鄧建軍，等.不同產(chǎn)地油菜蜂花粉抗氧化活性比較研究［J］.食品科學(xué)，2011，32(21):34-36.

［13］孫麗萍，楊佳林，徐響，等.油菜蜂花粉酚類化合物的初步分離和抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(23):52-56.

［14］徐響，何偉，孫麗萍，等.蜂花粉油脂抗氧化活性與類胡蘿卜素含量的相關(guān)性［J］.食品科學(xué)，2010，31(21):155-158.

［15］Campos MG，Bogdanows，Almeida-Muradianl B，et al.Pollen composition and standardisation of analytical methods［J］.Journal of Apicultural Research and Bee World，2008，47(2):156-163.