劉子記,曹振木,楊衍
(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點開放實驗室,海南儋州,571737)
種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料,是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)科技進步的載體。種子質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力,而種子質(zhì)量的好壞在很大程度上取決于種子的純度,開展種子純度檢測對保證種子質(zhì)量和提高生產(chǎn)效益具有重要意義。生物混雜及機械混雜是影響雜交種純度的主要原因,作物雜交種純度檢驗的常用方法主要包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術鑒定等[1]。種子形態(tài)差異有限,且易受環(huán)境條件影響,因此形態(tài)鑒定準確性較差;田間鑒定所需時間較長,成本較高,表型易受栽培措施和環(huán)境條件的影響,不同的鑒定者對同一性狀的評價也存在一定的差異,不能滿足快速檢測雜交種純度的需要;同工酶鑒定雖然準確、可靠、不受外界環(huán)境影響,但多態(tài)性不夠豐富,且有組織和器官特異性[2]。
隨著作物新品種數(shù)量的不斷增加,遺傳基礎日趨狹窄,傳統(tǒng)的鑒定方法不能有效區(qū)分遺傳關系較近的雜交種[3],難以滿足作物雜交種純度鑒定在精確度方面的要求。近年來,隨著DNA分子標記技術的問世及迅速發(fā)展,使得從基因組水平上檢測雜交種純度成為可能。分子標記技術能夠從DNA水平上揭示雜交子代與親本間的遺傳差異,不受植株生長季節(jié)的限制,不受基因表達、栽培條件和環(huán)境條件的影響,無器官、組織及發(fā)育特異性,能夠檢測微小的變異,多態(tài)性豐富,穩(wěn)定性高,可以大大縮短檢驗時間[4]。近年來,分子標記技術在國內(nèi)外被廣泛應用于作物雜交種純度鑒定。
RFLP (Restriction fragment length polymorphism)分子標記,即限制性片段長度多態(tài)性,其基本原理是利用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA,酶切后的DNA分子經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和變性,利用放射性同位素標記的探針與膜上的DNA片段雜交,檢測由堿基的插入、缺失、重排或點突變引起的多態(tài)性,是發(fā)展最早的DNA標記技術。
RFLP標記具有穩(wěn)定可靠、結(jié)果準確、不受植物發(fā)育階段影響等優(yōu)點。Smith等[5]利用RFLP分子標記成功鑒定了78個玉米雜交種品種;Matsuura等[6]研究結(jié)果表明,利用RFLP標記可快速檢測黃瓜雜交種的純度(表1)。但由于RFLP標記操作程序繁瑣、成本較高、多態(tài)性檢出率低、對DNA的需求量大且質(zhì)量要求較高、并且放射性同位素對操作人員身體有害,此法不適于進行大批量雜交種純度鑒定,在實際應用中受到限制。
RAPD(Random amplified polymorphic DNA)標記,即隨機擴增多態(tài)性DNA,該技術建立在PCR基礎上,以基因組DNA為模板,以10個堿基左右的隨機寡聚核苷酸序列為引物,檢測遺傳位點的多態(tài)性,可對未知序列的基因組進行多態(tài)性分析。該技術具有操作簡便、成本低、自動化程度高、分辨率高、實驗周期短、靈敏度強、檢測位點多、DNA用量少等優(yōu)點,能有效檢測從形態(tài)和生化指標上均無法檢測到的差異,被廣泛用于雜交種純度鑒定、基因定位和基因克隆等多方面研究。RAPD標記被成功應用于苦瓜[7]、冬瓜[8]、南瓜[9]和西瓜[10]等瓜類作物雜交種純度的鑒定;莫結(jié)勝等[11]利用RAPD標記鑒定雜交油葵種子純度,鑒定結(jié)果與大田檢測結(jié)果基本一致;朱海山等[12]和葛菊芬等[13]研究結(jié)果表明,RAPD標記可以用于番茄和辣椒等茄果類作物雜交種純度的鑒定;邵景俠等[14]成功利用RAPD標記對雜交小麥西雜一號進行純度鑒定(表1)。
由于RAPD標記屬于顯性標記,不能有效區(qū)分純合基因型和雜合基因型,另外其穩(wěn)定性和重復性較差,易受各種因素的影響,通常將其轉(zhuǎn)化為SCAR(Sequenced characterized amplified regions)標記,其原理是將多態(tài)性片段回收、克隆、測序后,設計出較長的引物進行特異擴增,可以顯著提高檢測的穩(wěn)定性和實用性。陳靈芝等[15]成功將RAPD標記轉(zhuǎn)化成SCAR標記,有效地將隴椒5號辣椒雜交種與母本區(qū)分開來;王飛等[16]建立了檢測金棚1號番茄雜交種純度的SCAR標記技術體系,為金棚1號番茄種子的生產(chǎn)與銷售提供了有效的檢測方法(表1)。
AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子標記,即擴增片段長度多態(tài)性,該技術利用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA,將特定的接頭與酶切后的DNA片段連接,根據(jù)接頭與酶切位點的序列設計PCR引物進行擴增,檢測遺傳位點多態(tài)性。
該技術具有多態(tài)性豐富、重復性高、可靠性好、不需要預先知道基因組序列信息等優(yōu)點。劉杰等[17]試驗結(jié)果證明,利用AFLP標記檢測向日葵雜交種純度是可行的;宋順華等[18]成功利用AFLP技術將90個大白菜品種區(qū)分開來;王玲平等[19]以瓠瓜雜交種浙蒲2號及其父、母本為材料,成功建立了利用AFLP分子標記進行瓠瓜雜交種純度鑒定的技術體系(表1)。但由于操作繁瑣、對試驗技能要求較高,試驗周期較長,對DNA的質(zhì)量要求很高,AFLP技術難以在種子純度鑒定中獲得廣泛應用。
SSR(Simple sequence repeats)標記,即簡單序列重復,是一類由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列,SSR兩側(cè)的序列一般相對保守,通過設計特異引物進行擴增,根據(jù)串聯(lián)重復單位數(shù)目的差異檢測多態(tài)性。
SSR標記具有數(shù)量豐富、在染色體上分布均勻、多態(tài)性高、共顯性遺傳、等位性變異豐富、重復性好、對DNA質(zhì)量要求不高且需要量少、操作簡單、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點,已在多種農(nóng)作物雜交種純度鑒定中得到應用。蘭剛等[2]、王愛娜等[20]和宋賢勇等[21]分別利用SSR標記對油菜雜交種合油雜2號、秦優(yōu)33和秦優(yōu)11進行純度鑒定,鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本一致;高海娜等[22]和苗明軍等[23]成功利用SSR標記對甘藍雜交種秦甘50和西園4號進行純度鑒定;管志坤等[24]利用SSR標記鑒定油綠3號大白菜品種純度,鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果非常接近;SSR 標記廣泛用于西瓜[25]、黃瓜[26,27]、瓠瓜[28]、甜瓜[29,30]雜交種純度鑒定,初步建立了利用SSR分子標記鑒定瓜類作物雜交種純度的技術體系;大量研究表明,SSR標記可應用于玉米雜交種鄭單 958[31]、黔單 16[32]、寧單 11[33]純度鑒定,與田間鑒定相比,準確性更高,速度更快,能大大提高檢測效率;王利英等[34]和白占兵等[35]研究結(jié)果表明,利用SSR分子標記檢測茄科作物茄子和辣椒雜交種純度可行且高效,具有一定的理論和應用價值;陳志偉等[36]研究結(jié)果證明,利用SSR分子標記可以快速、有效地鑒定大麥雜交種純度;田蕾等[37]利用多對SSR標記鑒定大豆雜交種純度,檢測結(jié)果完全一致;趙振卿等[38]利用SSR標記對花椰菜雜交種浙801純度進行鑒定,鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致(表1)。
開發(fā)基因組SSR標記成本較高、步驟繁瑣、費時費力。EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat)標記是根據(jù)EST序列中的簡單串聯(lián)重復序列開發(fā)的一種標記類型,具有SSR標記和EST技術的優(yōu)點,并且降低了開發(fā)成本、節(jié)省了開發(fā)時間、提高了開發(fā)效率,另外,EST序列高度的保守性使得EST-SSR標記在種與品種間有較好的通
用性,顯著提高了其利用價值。近年來,隨著基因組測序的發(fā)展,豐富的EST序列資源為EST-SSR標記的開發(fā)提供了有利途徑。盧銳等[39]篩選出2對EST-SSR標記,可用于黃瓜雜交種純度的鑒定;張庶等[40]研究結(jié)果表明,EST-SSR標記可以快速、準確地鑒別大白菜雜交種純度;張國裕等[41]利用ESTSSR標記對南瓜屬作物雜交種進行純度檢測,與田間鑒定結(jié)果相符;匡猛等[42]試驗結(jié)果證明,利用EST-SSR標記鑒定棉花雜交種純度與田間鑒定結(jié)果的相關性顯著高于基因組SSR標記;趙新等[43]篩選得到1對共顯性的EST-SSR標記,可用于花椰菜雜交種純度的鑒定,鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果較為一致。
表1 分子標記技術在作物雜交種純度鑒定中的應用
SRAP (Sequence-related amplified polymorphism)標記,即相關序列擴增多態(tài)性,該技術通過獨特的引物設計對基因的開放閱讀框區(qū)域進行擴增,上游引物與外顯子區(qū)域特異結(jié)合,下游引物與啟動子或內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合,檢測不同個體間內(nèi)含子、啟動子及間隔區(qū)序列長度不同產(chǎn)生的多態(tài)性。
該標記技術具有操作簡單、高共顯性、穩(wěn)定性強、分辨率較高、重復性好、成本低、在基因組中分布均勻等特點,在作物雜交種純度鑒定中有著廣泛的應用。扈新民等[44]利用SRAP分子標記對辣椒雜交種航椒4號進行純度檢測,與田間鑒定結(jié)果十分接近。鐘開勤等[45]研究結(jié)果證明,SRAP標記可以用于花椰菜雜交種純度鑒定;張永平等[46]和熊麗曼等[47]成功利用SRAP標記對甜瓜雜交種進行純度檢測;黃建都等[48]研究結(jié)果表明,SRAP標記技術可用于甘藍雜交種夏華2號純度鑒定,鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致;蓋樹鵬等[49]試驗結(jié)果證明,與SSR標記相比,利用SRAP標記檢測雜交種純度更接近田間鑒定結(jié)果(表1)。
隨著作物基因組測序工作的進展,新型分子標記 InDel (Insertion-deletion) 和 SNP (Single nucleotide polymorphism)的開發(fā)越來越容易,為利用新型分子標記進行作物雜交種純度鑒定創(chuàng)造了有利條件。InDel標記,即插入缺失標記,指由核苷酸水平上堿基的插入或缺失引起的多態(tài)性。SNP標記,即單核苷酸多態(tài)性,指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。
InDel和SNP標記具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、高通量和高度自動化等優(yōu)點。蘭青闊等[50]利用InDel標記檢測黃瓜津優(yōu)38雜交種純度,與SSR標記鑒定結(jié)果基本一致;張體付等[1]成功利用InDel標記對6個玉米雜交種進行了純度鑒定;蘭青闊等[51]基于SNP標記檢測黃瓜雜交種優(yōu)一種子純度,鑒定結(jié)果與SSR標記鑒定結(jié)果相符。
隨著生物技術的不斷發(fā)展,作物雜交種純度鑒定技術也由主要依賴田間鑒定進入分子鑒定水平,分子標記技術因其快速、準確、穩(wěn)定、節(jié)省大量人力和財力以及不受環(huán)境因素影響等特點,逐步成為作物雜交種純度檢測的首選工具,為雜交種純度鑒定提供了一種更為有效和可靠的方法[52]。不同的分子標記技術具有不同的優(yōu)缺點,在實際應用中,要根據(jù)研究對象充分發(fā)揮標記技術優(yōu)勢,這樣才能更準確、快速地達到鑒定目的。
在作物雜交種制種過程中,由于隔離不嚴導致的生物混雜是不可避免的現(xiàn)象,因此,利用單對標記鑒定雜交種純度具有一定的局限性。為確保鑒定結(jié)果的準確性和可靠性,應同時對供試樣品的多個遺傳位點進行檢測分析。選取位于染色體不同區(qū)域的標記組合起來進行檢測,不僅可以區(qū)分親本自交種,還能有效檢測出其他來源花粉所導致的生物性混雜。
分子生物學技術的飛速發(fā)展將會導致新的分子標記不斷出現(xiàn),現(xiàn)有的技術也會不斷得到完善。將分子標記技術與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合,可快速、準確地對雜交種純度進行早期檢測,對于保證種子質(zhì)量和優(yōu)良品種推廣具有重要意義。
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