β－聚蘋果酸/明膠微膠囊的制備

吳艷麗，馬 霞，俞鴻千

(上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海201418)

聚蘋果酸(poly malic acid，PMLA)是一種水溶性脂肪族聚酯，以L－蘋果酸(MLA)為唯一單體通過(guò)酯鍵聯(lián)接而成，它是天然多聚物中新近開發(fā)的一種生物多聚物。與許多其他天然多聚物不同，PMLA分子中有許多自由羧基，這些自由羧基賦予了它許多特別的性質(zhì)。PMLA最初是在1969年由微生物學(xué)家Shimada［1］等在研究一種環(huán)狀青霉索(Penicillium cyclopium)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，1979年Vert等首次用化學(xué)法將其合成出來(lái)［2］。PMLA以蘋果酸為基本結(jié)構(gòu)單元，以一個(gè)分子蘋果酸的－OH和另一個(gè)分子蘋果酸α－或β－COOH連接而成。有三種結(jié)構(gòu)的PMLA:α－型、β －型和，α，β －型，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示［3］?？捎猛ㄊ絇MLAxHyRz(x:L－蘋果酸單元所占比例，y:側(cè)基－COOH所占比例，R:側(cè)基取代基，z:側(cè)基取代基所占比例)表示［4］。

圖1 聚蘋果酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structures of poly malic acid

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

聚蘋果酸(PMLA) 實(shí)驗(yàn)室自制;明膠 Sigma;aOH、冰醋酸等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電子天平 YP1002N，上海精科;定式恒溫磁力攪拌器 Feb－94，上海閔行虹譜儀器廠;離心機(jī) L－530，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52A，上海亞榮生化儀器廠;冷凍干燥器 FD－1－50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;納米粒度儀 Zetasizer Nano ZS型，英國(guó)馬爾文儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)FE20，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;冷凍恒溫振蕩器 DHZ－D，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵制備聚蘋果酸［5－7］將發(fā)酵液于4200r/min離心30min，取清液。調(diào)pH至5，加等體積乙醇，于3500r/min離心10min，取清液。將清液濃縮至1/2體積，加2倍體積乙醇，于3500r/min離心10min，取清液。將清液濃縮至1/3體積，再加4倍體積乙醇，于4200r/min離心10min，取沉淀。用少量蒸餾水將沉淀溶解，透析2d，每4h換一次水。將透析好的溶液冷凍干燥24h，即得到產(chǎn)物PMLA。

1.2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn) 本課題是首次以PMLA和明膠為壁材制作微膠囊，根據(jù)復(fù)凝聚法的原理可知［8－10］，壁材分散相中含有兩種以上的親水膠體，通過(guò)調(diào)節(jié)介質(zhì)pH等，使帶異性電荷的兩種膠體之間因電荷中和而溶解度降低，引起相分離而產(chǎn)生凝聚。PMLA為陰性，明膠的等電點(diǎn)為4.8～9.0，pH低于4.8時(shí)表現(xiàn)為陽(yáng)性，反之大于9.0時(shí)表現(xiàn)為陰性。故PMLA和明膠可以聚合成為微膠囊壁材。

為了得到體系均勻、PdI較小、粒徑較小的微膠囊，首先要確定兩種壁材的滴加順序和滴加時(shí)所用的器材。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，選用輸液管，酸式滴定管和酸式滴定管頭加裝輸液針頭三種滴加器材，PMLA滴入明膠和明膠滴入PMLA兩種滴加順序。

1.2.3 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用 Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 Plackett－Burman 設(shè)計(jì)(表 1)［11］。對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的6個(gè)主要因素進(jìn)行篩選:即擇PMLA濃度，明膠濃度、明膠pH、滴速、轉(zhuǎn)速和攪拌反應(yīng)時(shí)間，外加5個(gè)虛擬變量，每個(gè)變量分別確定(+)和(－)兩個(gè)水平，以微膠囊粒徑和PdI為考察量［12］。

表1 Plackett－Burman設(shè)計(jì)因素水平Table 1 The levels of various factors in Plackett－Burman design

1.2.4 Box－Benhnken實(shí)驗(yàn) 在PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取較佳的因素和水平，采用響應(yīng)面分析方法對(duì)微膠囊制作條件進(jìn)行優(yōu)化，獲取最佳工藝參數(shù)，根據(jù)Box－Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［12］，選取對(duì)微膠囊PdI影響顯著的因素——明膠濃度，以及三個(gè)便于控制的因素PMLA濃度，明膠pH和反應(yīng)時(shí)間，運(yùn)用Design Expert軟件進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)水平見表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表2 Box－Benhnken設(shè)計(jì)因素水平Table 2 The levels of various factors in Box－Behnken Design

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用酸式滴定管加裝針頭制微膠囊，微膠囊的粒徑在200～400nm之間，但是體系PdI在0.5～1.0之間，偏大;用酸式滴定管制微膠囊，其粒徑在500～1200nm之間，偏大，但體系PdI很小;用輸液管制微膠囊，微膠囊粒徑很大，且滴速很難控制。通過(guò)對(duì)比，選擇酸式滴定管加裝針頭來(lái)制作微膠囊。

2.2 Plackett－Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，如表3和表4。

表3 對(duì)粒徑分析的偏回歸系數(shù)及因素顯著性分析Table 3 The particle diameter of the two model test of significance for the regression coefficients

表4 對(duì)PdI分析的偏回歸系數(shù)及因素顯著性分析Table 4 The PdI of the two model test of significance for the regression coefficients

表3可以明顯看出因素X3(滴速)、X6(轉(zhuǎn)速)、X8(虛擬因素)和X10(虛擬因素)為主要影響因子，其影響值分別為20.63、22.90、23.62和22.37，而另外3個(gè)虛擬因素X7、X9和X11對(duì)粒徑的低值影響(2.84、1.65、1.72)也表明了該模型有一定的適用性。經(jīng)影響因素篩選，得到以粒徑為響應(yīng)值的線性方程為:

Y1=359.78－38.60X3+40.67X6－41.30X8+40.20X10

方差分析模型的Prob(P)＞F值為0.0015，表明所得回歸方程達(dá)到極顯著，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合很好;負(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.8952，說(shuō)明相關(guān)性較好;校正決定系數(shù)Adj R2=0.8352，表明83.52%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋;通常情況下變化系數(shù)(CV)越低，實(shí)驗(yàn)的可信性和精密度越高，CV值等于10.01，表示PB實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度較好;精密度(Adeq Precision)是有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4.0視為合理。本實(shí)驗(yàn)精密度達(dá)到10.506。

同上分析得到:Y2=0.61－0.13X2+0.066X4+0.063X6

2.3 Box－Benhnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析［13－14］

用Design Expert軟件得到的分析結(jié)果，微膠囊粒徑的回歸方程為:

Y3=+299.48+39.20A－11.16B－93.77C+22.69D+51.85AB+6.90AC－122.20AD－65.17BC+176.10BD+125.92CD+154.13A2+45.16B2+130.98C2+53.34D2

表5 Box－Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 5 The results of Box－Behnken design

由表7可知，該模型F值為14.76(p＜0.0001)說(shuō)明模型顯著，僅有0.01%的可能產(chǎn)生噪音。在失擬項(xiàng)p=0.0592＞0.05不顯著，推斷這個(gè)模型不容易產(chǎn)生誤差。，R2=0.9365。這個(gè)模型中 C、BD、A2、C2是顯著影響因素。各因素對(duì)微膠囊粒徑的影響程度從大到小依次為明膠pH、PMLA濃度、反應(yīng)時(shí)間和明膠濃度。明膠pH的影響程度尤為顯著(p＜0.0001)，其次是 PMLA濃度(p＜0.05)，反應(yīng)時(shí)間和明膠濃度對(duì)微膠囊粒徑的影響不顯著(p＞0.05)。

等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素的交互作用顯著，而圓形則與之相反［15］。如圖2至圖6所示為因素之間的交互作用和對(duì)粒徑的影響。

表6 粒徑的二次模型方差分析Table 6 Particle size of two model analysis of variance

表7 粒徑的二次模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 The particle diameter of the two model test of significance for the regression coefficients

圖2 Y=f(A，B)響應(yīng)面立體分析Fig.2 Y=f(A，B)response surface analysis

圖3 Y=f(A，C)響應(yīng)面立體分析Fig.3 Y=f(A，C)response surface analysis

圖4 Y=f(A，D)響應(yīng)面立體分析Fig.4 Y=f(A，D)response surface analysis

圖5 Y=f(B，C)響應(yīng)面立體分析Fig.5 Y=f(B，C)response surface analysis

圖6 Y=f(C，D)響應(yīng)面立體分析Fig.6 Y=f(C，D)response surface analysis

圖7 Y=f(B，D)響應(yīng)面立體分析Fig.7 Y=f(B，D)response surface analysis

通過(guò)Design Expert軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算，得到最優(yōu)條件組合為:PMLA濃度0.09%，明膠濃度0.13%，明膠 pH4.0，反應(yīng)時(shí)間24.36min。在此條件下，可以得到粒徑為204.57nm微膠囊。

為了方便實(shí)驗(yàn)，取PMLA濃度0.10%，明膠濃度0.13%，明膠pH4.0，反應(yīng)時(shí)間25min時(shí)驗(yàn)證回歸模型的有效性，根據(jù)得到的最優(yōu)條件，做三組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，實(shí)際測(cè)量值288.37nm與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型是合理有效的且具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法建立了制作PMLA－明膠微膠囊的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。通過(guò)對(duì)模型響應(yīng)面圖及等高線圖進(jìn)行分析，獲得影響微膠囊粒徑和體系PdI的最佳條件，并利用模型方程對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明:PMLA濃度、明膠pH對(duì)微膠囊粒徑有顯著影響，反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系PdI有顯著影響;PMLA濃度與明膠pH對(duì)粒徑的交互影響不顯著;PMLA濃度與明膠濃度、明膠濃度與明膠pH對(duì)PdI的交互影響顯著。由粒徑和PdI的二次多項(xiàng)式回歸方程可知:PMLA濃度0.1%，明膠濃度0.13%，明膠pH4.0，反應(yīng)時(shí)間25min時(shí)，微膠囊粒徑為288.37nm。而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，說(shuō)明該模型是合理有效的，具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

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