聯(lián)合檢測P504S、VEGF和MVD在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

廖勇，黃建林，閻洪濤，董丹丹，蔣建春

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院泌尿外科，成都610072；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院病理科，成都610072；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都610075）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系常見的惡性腫瘤之一，其生物學(xué)行為表現(xiàn)較復(fù)雜。腫瘤血管是惡性腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，微血管密度（MVD）常用來評價腫瘤的血管生成，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可調(diào)控血管的生成，其表達(dá)與 MVD存在相關(guān)性。α－甲?；o酶A消旋酶（P504S）是一種新近確認(rèn)的特異性分子標(biāo)記物，在許多腫瘤如前列腺癌、RCC、結(jié)腸癌、乳腺癌等都有較高的表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)標(biāo)記菌葡萄糖聚合物（labeled dextran polymer，LDP）法對RCC組織中P504S、VEGF的表達(dá)及MVD進(jìn)行了觀察比較，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2003年1月～2010年12月于四川省人民醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)且病理證實為RCC的患者67例，患者中位年齡48.1歲（25～69歲），其中男42例，女25例。所有病例術(shù)前均未接受化療、放療和免疫治療。按WHO1997年病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)：G1級17例，G2級39例，G3級11例；按2002年AJCC的 TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：I期（T1）16例，Ⅱ期（T2）21例，Ⅲ（T3）19例，Ⅳ期（T4）11例。手術(shù)后對患者進(jìn)行隨訪，隨訪年限1～7年，其中有完整隨訪資料的患者共57例。對照組為10例因腎外傷等原因行腎臟手術(shù)的成年患者，標(biāo)本為切除的非腫瘤腎組織。

1.2 病理方法

所有病理標(biāo)本均用15%甲醛液浸泡、固定，常規(guī)取材、脫水和石蠟包埋，連續(xù)4μm厚切片備染。分別進(jìn)行常規(guī)HE染色、免疫組化P504S、VEGF和CD34染色。一抗分別為兔抗人P504S多克隆抗體（福州邁新公司產(chǎn)品）、單克隆抗體VEGF（工作濃度1∶100，Zymed公司產(chǎn)品）、抗CD34單克隆抗體（工作濃度1∶50，DAKO公司產(chǎn)品），二抗均為EnvisionTM檢測系統(tǒng)（DAKO公司產(chǎn)品）。采用免疫組織化學(xué)LDP法進(jìn)行檢測。陽性對照采用已知的陽性切片，陰性對照采用PBS液代替一抗。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 P504S染色 陽性為細(xì)胞質(zhì)著色。分級標(biāo)準(zhǔn)：陽性腫瘤細(xì)胞＜5%為（－），5%～25%為（＋），26%～50%（＋＋），＞50%為（＋＋＋）。

1.3.2 VEGF染色 陽性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)物。以染色強度和陽性細(xì)胞百分率得分之和判定VEGF的表達(dá)強度：總分0～3為低表達(dá)，4～6為高表達(dá)。其中1）染色強度：陰性為0，弱陽性為1，陽性為2，強陽性為3；2）陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞0%為0，＜25%為1，26%～50%為2，＞50%為3。

1.3.3 MVD評估 采用CD34染色，陽性為任何血管內(nèi)皮細(xì)胞（包括單個內(nèi)皮細(xì)胞）的細(xì)胞核和／或細(xì)胞漿和／或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色染色。評估MVD分兩步，先將CD34染色的切片置于低倍鏡下（×100）觀察，確認(rèn)血管數(shù)最高的區(qū)域；然后隨機選擇5個微血管密集區(qū)域于高倍顯微鏡下（×400）觀察，并記錄微血管數(shù)（MVC），取其平均值即為MVD值，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較及計數(shù)資料采用方差分析和χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P504S在RCC及正常腎組織中的表達(dá)

P504S呈彌漫胞質(zhì)陽性，在正常腎組織的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管表達(dá)，而集合管和腎小球為陰性。其中僅1例呈陽性表達(dá)，且為弱陽性。P504S在67例RCC組織中有44例呈陽性表達(dá)，P504S在RCC與正常腎組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（見表1）。

表1 RCC與正常腎組織中P504S的表達(dá)［n（%）］

2.2 VEGF的表達(dá)和RCC MVD分布

67例RCC組織中VEGF陽性表達(dá)與10例正常腎組織比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。67例RCC的平均MVD為（52.75±12.76），10例正常腎組織為（15.63±6.32），前者明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。從形態(tài)分布上看，RCC微血管呈網(wǎng)狀、管狀散在或彌漫性，而正常腎組織微血管形態(tài)及分布相對均勻、規(guī)范。此外，不同區(qū)域MVD也不相同，在腫瘤間質(zhì)和腫瘤組織邊緣部血管豐富，而在腫瘤中央近壞死區(qū)域，血管分布稀疏或者缺如（見表2）。

表2 RCC與正常腎組織中VEGF的表達(dá)［n（%）］和MVD

2.3 P504S表達(dá)與VEGF的表達(dá)及MVD的關(guān)系

P504S表達(dá)與VEGF表達(dá)、腫瘤MVD之間存在正相關(guān)性，P504S陽性表達(dá)組（n＝44）：VEGF陽性表達(dá)38例，陰性表達(dá)6例，MVD值為（58.61±21.37）；而P504S陰性表達(dá)組（n＝23）：VEGF陽性表達(dá)14例，陰性表達(dá)9例，MVD值為（31.25±16.43）。兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（VEGF陽性表達(dá)率比較P＝0.017，MVD值比較P＜0.01）（見表3）。

表3 P504S陽性表達(dá)與陰性表達(dá)中VEGF的表達(dá)［n（%）］和MVD

2.4 P504S、VEGF和 MVD與RCC臨床、病理學(xué)特點的相關(guān)性

按腫瘤不同級別進(jìn)行分組比較P504S的表達(dá)，G1級與G2級、G1級與G3級、G2級與G3級比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。按分期比較，高分期組（T3～T4期）P504S表達(dá)明顯高于低分期組（T1～T2期），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。可見，RCC組織中P504S的表達(dá)水平與RCC的病理分級和臨床分期均呈正相關(guān)。

分析結(jié)果表示：各組之間比較，VEGF表達(dá)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。組織學(xué)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組每兩組之間 MVD比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；臨床分期各組之間 MVD比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。所以，VEGF的表達(dá)與RCC MVD兩者皆與RCC病理分級、臨床分期有密切關(guān)系。

P504S、VEGF的表達(dá)與RCC的MVD三者還與RCC有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（n＝6）MVD為（89.27±22.14），VEGF低表達(dá)0例，高表達(dá)6例，P504S低表達(dá)0例，高表達(dá)6例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（n＝61）MVD為（40.13±19.23），VEGF低表達(dá)29例，高表達(dá)32例，P504S低表達(dá)38例，高表達(dá)23例，P＜0.01。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（n＝13）MVD為（82.72±19.73），VEGF低表達(dá)1例，高表達(dá)12例，P504S低表達(dá)0例，高表達(dá)13例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（n＝54）MVD為（39.13±17.12），VEGF低表達(dá)28例，高表達(dá)26例，P504S低表達(dá)32例，高表達(dá)22例，P＜0.01（見表4）。

2.5 P504S、VEGF和MVD與RCC預(yù)后的關(guān)系

對有完整隨訪資料的患者研究表明：隨訪5年內(nèi)死亡者P504S、VEGF和MVD的表達(dá)均高于存活5年以上者，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01（見表5）。

表4 P504S、VEGF和MVD與RCC臨床病理學(xué)特點的相關(guān)性

表5 P504S、VEGF、MVD與術(shù)后生存時間的關(guān)系

3 討論

3.1 P504S在RCC中表達(dá)的意義

P504S基因定位于染色體5p13，全長1 621bp，編碼382個氨基酸，具有在腫瘤組織中特異性表達(dá)的特點。P504S是一種新近確認(rèn)的特異性分子標(biāo)記物，存在于胞漿內(nèi)過氧化物酶體和線粒體上，目前學(xué)者［1］認(rèn)為P504S可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。P504S一般在正常組織中無表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞突變成腫瘤細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)的代謝也發(fā)生了變化，在有關(guān)基因的調(diào)控下該蛋白產(chǎn)物過度表達(dá)，致P504S出現(xiàn)陽性。據(jù)文獻(xiàn)［2，3］報道，結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、腎腺癌等腫瘤組織中均有陽性表達(dá)，在腫瘤的臨床病理診斷中起重要的作用，且與腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后有關(guān)。

在正常腎組織，P504S表達(dá)于近曲小管和遠(yuǎn)曲小管，呈弱至中等程度陽性。本實驗中RCC組織中P504S陽性表達(dá)率達(dá)65.67%，且多呈中等和強陽性表達(dá)，提示多數(shù)RCC中有β氧化酶大量增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，P504S的陽性表達(dá)與RCC的臨床分期和腫瘤細(xì)胞的分化程度均呈現(xiàn)正相關(guān)性。而在10例正常腎組織中僅1例呈弱陽性表達(dá)，證實P504S對RCC較敏感。因此，P504S可作為RCC診斷和鑒別診斷的重要參考指標(biāo)。此外，隨訪資料顯示P504S陽性表達(dá)率低的患者術(shù)后生存期明顯高于陽性表達(dá)率高的患者，說明P504S標(biāo)記物對RCC患者的預(yù)后也有一定參考價值。

3.2 VEGF在RCC中表達(dá)的意義

腫瘤的血管新生是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中不可或缺的一個重要環(huán)節(jié)，已成為許多腫瘤的研究熱點，它包括腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的毛細(xì)血管形成以及腫瘤組織中血液循環(huán)建立的復(fù)雜過程［4］。而新生血管的形成又受多種因子的調(diào)控，包括血管生長因子和血管生成抑制因子，其中VEGF的作用尤為突出，它對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管構(gòu)建有較強的調(diào)控作用，有研究［5］證實其與腫瘤的分級、分期及預(yù)后有關(guān)。VEGF是一種典型的外分泌蛋白，它可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜受體結(jié)合，從而發(fā)揮相關(guān)功能，而腫瘤組織能繼續(xù)生長和轉(zhuǎn)移的必要內(nèi)在條件之一就是腫瘤組織中VEGF的高表達(dá)。本研究顯示VEGF低表達(dá)組的MVD值低于高表達(dá)組（P＜0.01），該結(jié)果與上述理論是一致的。

本研究結(jié)果還顯示，RCC組織中VEGF的表達(dá)強度隨RCC病理分級的增高而升高（P＜0.01），說明VEGF的表達(dá)與RCC的腫瘤細(xì)胞分化程度密切相關(guān)；此外，VEGF的表達(dá)強度也隨RCC臨床分期的增高升高（P＜0.01），說明VEGF的表達(dá)強度與腫瘤的侵襲能力也相關(guān)。所以臨床上可將RCC組織中VEGF的表達(dá)程度作為一個判斷RCC惡性程度和侵襲能力的指標(biāo)。

3.3 檢測RCC組織中MVD的臨床意義

人體正常組織血管的增殖受機體嚴(yán)格調(diào)節(jié)，而腫瘤的血管增殖往往是無法控制的［6］，其中最重要的就是微血管（microvessel，MV）的形成。MV包括組織中的微動脈、微靜脈及毛細(xì)血管。腫瘤組織中新生的MV發(fā)育不成熟，管壁僅為一層常有裂隙的內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏基底膜；內(nèi)皮細(xì)胞分泌的纖維蛋白溶解酶又可破壞基質(zhì)屏障，使腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入MV，經(jīng)血循環(huán)在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶，所以腫瘤MV是腫瘤血行轉(zhuǎn)移的重要因素［7］。計數(shù)原發(fā)腫瘤中瘤內(nèi)MV數(shù)是目前最常使用的量化腫瘤血管生成的方法，而CD34是標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高的標(biāo)記抗原，檢測MVD多采用CD34染色，本研究也采用此法。

目前研究認(rèn)為，隨著MVD的增加，腫瘤侵襲能力也會增加；更有學(xué)者［7］認(rèn)為，MV侵犯和血管新生可作為一項預(yù)測RCC惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)。本研究中以CD34標(biāo)記MV發(fā)現(xiàn)，RCC組織中MV形態(tài)和數(shù)量各異，密度分布也不均勻；RCC組織中的MVD明顯高于正常腎組織的MVD，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其次，隨著腫瘤組織學(xué)分級和腫瘤臨床分期的增高，RCC中MVD也隨之升高，表明RCC中MVD與腫瘤的惡性程度及其侵襲能力呈正相關(guān)性。此外，RCC的MVD與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這些結(jié)果均與文獻(xiàn)報道相似。

3.4 P504S表達(dá)與VEGF表達(dá)及MVD的相關(guān)性和臨床意義

本研究結(jié)果顯示，RCC組織中P504S的表達(dá)與VEGF表達(dá)及MVD均呈正相關(guān)性，表明VEGF在腎癌中是血管生成調(diào)控的關(guān)鍵促血管生成因子［8］。新生血管的形成對腫瘤增殖不可缺少，因為其保證了腫瘤代謝的需求。因此，當(dāng)RCC中VEGF的過表達(dá)將導(dǎo)致腫瘤間質(zhì)MVD增高這一結(jié)果，必將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)的代謝也發(fā)生變化，致多數(shù)RCC中有β氧化酶大量增加，即在有關(guān)基因的調(diào)控下使P504S蛋白產(chǎn)物過度表達(dá)，P504S出現(xiàn)陽性表達(dá)。

RCC的生物學(xué)行為表現(xiàn)較復(fù)雜，在臨床上也難以準(zhǔn)確預(yù)測其預(yù)后。本研究中采用免疫組化LDP對RCC組織中P504S、VEGF及 MVD進(jìn)行了檢測，同時探討了P504S及VEGF、MVD與RCC預(yù)后的關(guān)系。隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)5年內(nèi)死亡者P504S表達(dá)、VEGF表達(dá)以及MVD測值均要高于存活5年以上者（P＜0.01），說明P504S、VEGF表達(dá)的強度及MVD數(shù)值的變化與RCC的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。臨床上通過檢測RCC的P504S、VEGF表達(dá)和MVD，有助于判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后特點。

綜上所述，P504S、VEGF與 MVD均是反映RCC細(xì)胞生物學(xué)行為較理想的標(biāo)記物，臨床上聯(lián)合檢測可作為預(yù)測RCC惡性程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的一項重要參考指標(biāo)。

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