皖西食用百合莖尖脫毒培養(yǎng)

張傳海，孫傳伯，謝升旺，王維杰，唐文娟，程夢思

（1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安237012；2.安徽中升生物科技有限公司，安徽 霍山237200）

百合是百合科百合屬（Lilium）植物的總稱，全世界共有90余種。我國是世界百合的起源中心，原產于我國的約有46種18變種［1］。百合是藥食同源的多年生草本經濟作物，根據其用途可分為食用、藥用和觀賞百合等3類，其中，食用百合被視為“蔬菜人參”，具有潤肺、祛痰、健胃、清熱利尿等功效［2］。

我國擁有非常悠久的食用百合栽培歷史，近年來隨著人民生活水平的不斷提高和百合需求量的日益增長，百合種植面積也在迅速擴大，成為宜栽地區(qū)調整農業(yè)產業(yè)結構的重要作物品種之一。地處皖西大別山區(qū)的六安市霍山、金寨、舒城、裕安等縣區(qū)，食用百合的年種植面積達5萬畝以上，已發(fā)展成為區(qū)域性特色農業(yè)產業(yè)［3］。然而，對霍山等地百合種植區(qū)的調查發(fā)現，近年來以灰霉病、葉尖干枯病、炭疽病以及病毒病等為主的百合病害日趨嚴重［4］，直接影響到百合生產的正常進行，對百合產業(yè)的健康發(fā)展構成了威脅。

現實生產中，百合的繁殖主要是依靠鱗莖進行無性擴繁，在此模式下，一旦母球感染病毒，就會在植株體內不斷積累并傳代，形成長期危害。要解決因病毒侵染導致的種性退化問題，利用莖尖培養(yǎng)技術生產百合脫毒種苗是一條可行的途徑［5］。

本文以皖西食用百合主栽品種卷丹（Lilium lancifoliumThunb）的鱗莖為材料，開展百合鱗莖的莖尖離體培養(yǎng)研究，重點探討不同激素條件對不定芽的誘導發(fā)生、繼代增殖以及誘導生根等的影響，旨在為建立皖西食用百合脫毒種苗生產技術體系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以食用百合卷丹的新鮮鱗莖為材料，濕沙埋藏備用。

1.1.2 儀器

電熱蒸汽滅菌器（YX-450，上海三申），超凈工作臺（蘇州凈化），體視顯微鏡（SZX7-1093，奧林巴斯），恒溫培養(yǎng)箱（PYX-150HA，科立儀器）。

1.1.3 試劑

乙醇，HgCl2，6-芐氨 基 嘌 呤 （6-BA），萘 乙 酸（NAA），MS培養(yǎng)基所需試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的種類與配制

芽誘導的培養(yǎng)基：MS＋蔗糖30g／L＋0.05%活性炭＋瓊脂粉4.5g／L＋植物激素組合（表1、2）；用15mm×80mm的指管進行分裝。

不定芽增殖的培養(yǎng)基：MS＋蔗糖30g／L＋瓊脂粉4.5g／L＋植物激素組合（表3）；用容積250mL、帶透氣孔的培養(yǎng)瓶分裝，每瓶50mL。

誘導生根的培養(yǎng)基：1／2MS＋蔗糖25g／L＋瓊脂粉4.5g／L＋植物激素組合（表4）；用容積250mL、瓶蓋帶透氣孔的塑料培養(yǎng)瓶分裝，每瓶約50mL。

上述各類培養(yǎng)基的配制，皆按常規(guī)流程進行，調整pH值至5.9，分裝后，高壓濕熱滅菌，冷凝備用。

1.2.2 鱗莖的預處理

熱處理組：取百合鱗莖，用自來水洗凈外表，剝去外層鱗片，使鱗莖直徑縮小至1.5cm左右，裝于小型塑料自封袋中，置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中避光保溫處理72h，然后進入莖尖剝離操作步驟。

未熱處理組：在接種的當天，取百合鱗莖，用自來水洗凈外表，剝去外層鱗片，然后進入莖尖剝離操作程序。

1.2.3 鱗莖的消毒與莖尖剝取

鱗莖的消毒：取預處理后的百合鱗莖（熱處理組和未熱處理組要分開），用自來水清洗外表，瀝水，在超凈工作臺上進行表面消毒：先用75%乙醇浸潤10 s，快速倒去乙醇，用無菌水浸洗2～3次，然后將鱗莖轉入0.1%HgCl2溶液中浸泡消毒10min，再用無菌水清洗4～5遍，瀝水，置于無菌培養(yǎng)皿中。

莖尖剝取和接種：消毒好的每個鱗莖，先用肉眼剝去外部鱗片，再在體視顯微鏡下快速剝取直徑0.5～1.0mm大小的莖尖，迅速接種到各芽誘導培養(yǎng)基上。

1.2.4 莖尖接種和芽誘導培養(yǎng)

每支芽誘導指管培養(yǎng)基上接種1個莖尖，每個激素處理組共接種10個莖尖。接種完成后，轉入光照培養(yǎng)箱中集中培養(yǎng)，誘導不定芽發(fā)生。培養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，光照強度1500lx，光照時間12h／d。定期觀察莖尖生長發(fā)育進程，培養(yǎng)至第45d，統計不定芽誘導發(fā)生情況。

1.2.5 不定芽的繼代增殖培養(yǎng)

將莖尖誘導培養(yǎng)產生的不定芽分成單個后，轉接到各組芽增殖培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，每個激素處理組接種5瓶、共15個不定芽，培養(yǎng)條件與上述芽誘導的相同。培養(yǎng)至30d，統計不定芽的增殖情況。

1.2.6 誘導生根培養(yǎng)

繼代增殖后，將帶葉無根芽苗分成單株，轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，每一激素處理組接種5瓶、共15個芽苗，培養(yǎng)條件同芽誘導。培養(yǎng)至第25 d，統計生根情況。

1.2.7 數據統計分析

平均芽分化量＝誘導發(fā)生的不定芽總數／產芽的總莖尖數；不定芽誘導率（%）＝（產生不定芽的莖尖數／成活的莖尖數）×100；芽增殖系數＝增殖后的不定芽總數／接種的不定芽總數；芽增殖率（%）＝（新增殖的不定芽數／接種的不定芽總數）×100；生根誘導率（%）＝（生根的不定芽數／接種的不定芽數）×100。

2 結果與分析

2.1 不定芽的誘導發(fā)生

觀察了各處理的不定芽誘導發(fā)生進程?？傮w上，接種后第6d左右莖尖即啟動生長；第12d，成活的莖尖開始膨大變綠；第20d，不定芽明顯形成，而未成活的莖尖變褐枯死；第26d，不定芽增殖形成叢芽，幼葉抽展，成為帶葉的無根芽苗。

培養(yǎng)至45d，對不定芽的分化發(fā)生情況進行了統計分析，結果見表1和表2。在熱處理組和未熱處理組中，不同激素組合對不定芽的誘導效應表現出較高的一致性；熱處理組和未熱處理組皆以6-BA 1.0 mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合為優(yōu)，其在熱處理組的芽誘導率為88.9%，平均芽分化量為4.5個，在未熱處理組的芽誘導率為87.5%，平均芽分化量為4.9個?？傮w上，鱗莖的熱處理對于后期接種莖尖的成活和芽分化呈現負向作用，表現為芽誘導率和平均芽分化量皆有一定程度下降，但與未熱處理組相比較，不定芽發(fā)生情況并無顯著差異。

表1 熱處理組的莖尖培養(yǎng)誘導不定芽發(fā)生情況

2.2 不定芽的繼代增殖

將誘導發(fā)生的不定芽分組轉接到芽增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第30d，統計各激素處理組的不定芽增殖情況。結果（表3）表明，適當降低6-BA和NAA的使用濃度有利于不定芽的增殖和生長，較高濃度水平的6-BA對于不定芽的增殖反而有抑制作用。

表3 外源植物激素對莖尖培養(yǎng)不定芽增殖的影響

在設定的各激素處理組中，以6-BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合為佳，芽增殖系數為最高的4.20，芽增殖率為320%。而不添加任何外源激素的對照組，不定芽的增殖效率最低，表明外源植物激素對于百合不定芽的增殖培養(yǎng)是必需的。

2.3 外源植物激素對不定芽的誘導生根效應

本實驗的生根培養(yǎng)基中，NAA 設置0.1、0.5、1.0、1.5mg／L共4個濃度水平，與6-BA的0.2、0.5 mg／L進行完全組合，另以不加任何植物激素的為對照組，統計結果見表4。

將不定芽接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至第7～10 d，不定芽的基部開始長出毛狀白根，20～25d不定根出齊。培養(yǎng)至第30d，統計分析誘導生根情況，結果見表4。有2個激素組的生根率達到100%，但以NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.2mg／L組的誘導生根效果最好，根系較發(fā)達、健壯。

表4 植物激素對百合不定芽誘導生根的影響

3 討論

筆者前期以卷丹的鱗片為外植體，研究了植物激素對不定芽分化發(fā)生、繼代增殖以及誘導生根的影響［6］。在此基礎上，本文進一步探討了卷丹的莖尖離體培養(yǎng)基本條件。將莖尖分化實驗分為熱處理和未熱處理兩組，結果表明，兩組皆以6-BA 1.0mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合對于不定芽的分化發(fā)生為優(yōu)；鱗莖的熱處理對于莖尖的成活和芽分化表現出一定程度的負影響，但總體上與未熱處理組的差異并不顯著。不定芽的繼代增殖培養(yǎng)，以6-BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素組合最佳，芽增殖系數為4.20，芽增殖率達320%。芽誘導生根實驗中，以6-BA 0.2mg／L＋NAA 1.0mg／L組的誘導生根效果最好，根數較多，且根系健壯。

植物莖尖培養(yǎng)是一項成熟的現代生物技術，已成功應用于多種植物的脫毒苗規(guī)?；a。侵入植物的病毒一般需要通過維管組織進行轉移，但莖尖分生組織尚未形成維管束，幾乎不含或很少含有病毒，因此，剝取莖尖無毒生長點進行離體培養(yǎng)和擴繁，便可能獲得大量的脫毒苗。莖尖成活率和再生苗的脫毒率，可作為衡量莖尖培養(yǎng)是否成功的重要指標。

研究表明，一定的高溫處理能將病毒鈍化，使其失去活性；但單純對植物材料進行熱處理，脫毒率較低。將熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合，則可大大提高脫毒效率。本實驗先對食用百合的鱗莖外植體分為熱處理和未熱處理兩種預處理，然后再進行莖尖培養(yǎng)比較試驗，目的是探討在兩種預處理情況下的莖尖成活與分化情況以及脫毒效果的差異。關于兩組試驗再生苗的脫毒效果如何，將另作分析報道。

建立百合脫毒種苗生產技術體系和繁育基地，對于促進百合產業(yè)的健康發(fā)展具有重要現實意義。然而，百合的脫毒種球生產供應并不那樣簡單。從脫毒苗繁育，到種苗移栽和種球繁殖，再到種球的后期加工貯藏，需要形成完整配套的生產技術體系和標準，而且還涉及生產管理模式和成本控制等一系列基礎環(huán)節(jié)［7］。在國內，關于百合的脫毒快繁已有不少相關研究報道［8-10］，從現實情況看，要將這些研究成果應用于生產，真正形成自己的技術體系，建立完善的生產基地，還有相當多的問題需要加以解決。

［1］趙祥云，王樹棟，陳新霞，等.百合［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2000.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［Z］.北京：化學工業(yè)出版社，2005.

［3］儲成虎，武麗，許自文，等.皖西大別山區(qū)食用百合無公害高 產 栽 培 技 術 ［J］.安 徽 農 業(yè) 科 學，2005，33（11）：2068-2069.

［4］鄧余良，彭慧，金鑫.皖西山區(qū)卷丹病害流行原因及其防治技術［J］.中國植保導刊，2006，（9）：28-28，21.

［5］張建華，莊天明，陳銀華.百合無病毒苗快速繁殖技術［J］.上海交通大學學報，2006，24（4）：370-373.

［6］張傳海，葛自兵，白雪峰，等.食用百合卷丹離體培養(yǎng)再生體系的建立［J］.皖西學院學報，2012，28（2）：1-3，6.

［7］熊麗，王祥寧，張藝萍，等.百合種球國產化的回顧及發(fā)展商榷［J］.西南農業(yè)學報，2008，21（3）：859-862.

［8］張藝萍，屈云慧，王祥寧，等.提高百合莖尖組織培養(yǎng)脫毒效率研究［J］.廣東農業(yè)科學，2007，（1）：37-38.

［9］朱旭東，田松青，成海鐘，等.東方百合莖尖組培技術研究［J］.安徽農業(yè)科學，2009，37（5）：1922-1923，1962.

［10］王麗花，王繼華，瞿素萍，等.百合病毒脫毒及檢測技術研究進展［J］.廣西農業(yè)科學，2007，38（6）：673-676.