離子對RP-HPLC法測定利塞膦酸鈉原料藥及其制劑的含量Δ

張立峰，劉燦仿（邢臺醫(yī)學高等?？茖W校藥劑教研室，河北邢臺 054000）

利塞膦酸鈉原料藥質量檢測標準采用國家食品藥品監(jiān)督管理局標準[1]，該標準中含量采用電位滴定法測定，操作煩瑣，不適合常規(guī)檢測。同時，雖有文獻[2-9]報道采用高效液相色譜（HPLC）法檢測雙膦酸鹽類藥物的含量，但由于該藥中含有較多離子基團，故采用文獻報道的方法很難在固定相上保留這些基團，從而影響測定結果的準確性。筆者經過多次試驗，建立了采用離子對反相（RP）-HPLC法測定利塞膦酸鈉原料藥及其注射劑含量的方法以及對其合成過程中殘余的原料2-（3-吡啶）乙酸和其他氧化分解產物的分離分析方法，從而為該藥的質量控制提供了一種可靠的分析手段。

1 材料

液相色譜儀系統(tǒng)包括SP8810型輸液泵、SP8450型紫外-可見檢測器（美國光譜-物理公司）；HW-2000色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；Rheodyne 7725i型六通進樣閥（美國Rheodyne公司）。

利塞膦酸鈉對照品（批號：20110716，采用電位滴定法測定純度：99.67%）、2-（3-吡啶）乙酸對照品（批號：20110324，采用HPLC法測定純度：99.49%）均由河北醫(yī)科大學藥學院提供；利塞膦酸鈉原料藥（批號：20110314、20110325、20110406，純度：均＞99%）、注射用利塞膦酸鈉（批號：20110811、20110813、20110815，規(guī)格：每支5 mg）、利塞膦酸鈉注射液（批號：20120107、20120110、20120117，規(guī)格：5 mg∶2 ml）均由河北醫(yī)科大學制藥廠提供；四丁基溴化銨、磷酸二氫鈉均為分析純；試驗用水均使用二次重蒸水；甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-5 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液（含6 mmol/L離子對試劑四丁基溴化銨溶液，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.0）（20∶80，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：240 nm；進樣量：20 μl；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備。稱取利塞膦酸鈉對照品約25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加水溶解、稀釋、定容至刻度，搖勻，即得質量濃度約為1.0 mg/ml的對照品貯備液，再用流動相稀釋即得質量濃度分別約為8.00、10.00、12.00 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備。稱取利塞膦酸鈉原料藥或注射用利塞膦酸鈉約25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入流動相稀釋得質量濃度約為1.0 mg/ml的供試品貯備液，再用流動相稀釋得質量濃度約為10.00 μg/ml的供試品溶液。

精密量取利塞膦酸鈉注射液約10 ml，置于25 ml量瓶中，加入流動相稀釋得質量濃度約為1.0 mg/ml的供試品貯備液，再用流動相稀釋得質量濃度約為10.00 μg/ml的供試品溶液。

我們把高層建筑可以看作是固定在地面上的一個懸臂結構，它一方面受垂直荷載作用，另一方面受水平荷載作用。其中，垂直荷載使結構產生軸力，其大小與建筑物高度基本呈線性關系；水平荷載使結構產生彎矩，其大小與建筑物高度基本呈二次方變化。一般情況下，對地震作用效應影響較大的是水平荷載，高層建筑抗震結構設計首先要保證建筑物的結構要有較大剛度。高層建筑結構設計的主要矛盾就是抗水平力，我們應根據抗震等級和水平荷載的分布設計采用不同的結構體系。

稱取2-（3-吡啶）乙酸對照品25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入流動相稀釋得濃度約為1.0 mg/ml的溶液備用。

2.3 線性關系考察

精密量取利塞膦酸鈉對照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定，以峰面積（A）對質量濃度（c）作圖，進行線性回歸，得回歸方程為：A＝7.22×103+2.82×103c（r＝0.9998）。表明利塞膦酸鈉檢測質量濃度線性范圍為79.96～799.6 μg/ml。

2.4 穩(wěn)定性考察

取注射用利塞膦酸鈉供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果RSD＝0.4%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液，連續(xù)進樣5次測定。結果峰面積值RSD＝0.3%（n＝5），表明本方法精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取同批注射用利塞膦酸鈉樣品5份，制備供試品溶液，進樣。結果平均含量RSD＝0.5%（n＝5），表明本方法重復性良好。

2.7 回收率試驗

取注射用利塞膦酸鈉同批樣品，按測試濃度的80%、100%、120%3個梯度分別加入對照品，每個質量濃度取3份樣品，同法操作，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝3）Tab 1Results of recovery tests（n＝3）

2.8 樣品含量測定

準確稱取注射用利塞膦酸鈉及對照品適量，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液、對照品溶液，進樣，記錄峰面積，按外標法以峰面積計算含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2Content determination of samples（n＝3）

2.9 色譜條件的篩選

2.9.1 色譜柱的選擇。分別以Hypersil C8和Hypersil C18柱作固定相，考察磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）、流動相pH值（7.0）及甲醇的體積分數（20%）一定時，增加流動相中離子對試劑（同時有減尾劑的作用）四丁基溴化銨溶液濃度（0～8 mmol/L）對利塞膦酸鈉峰形的改善情況。結果顯示，以Hypersil C18作固定相，利塞膦酸鈉的峰形較差且難以改善；而以Hypersil C8作固定相，增加離子對試劑濃度，峰形得到明顯改善，能夠滿足要求。因此最終以Hypersil C8柱作為固定相。

2.9.2 影響色譜行為的因素考察。流動相的pH值、離子對試劑濃度、有機改性劑的體積分數及緩沖液濃度對利塞膦酸鈉及其有關化合物[主要指2-（3-吡啶）乙酸]的保留行為有較大的影響。為了獲得最佳的分離效果，筆者考察了這些因素對其色譜行為的影響。

（1）pH值的影響。利塞膦酸為四元有機酸，其水溶液顯酸性（體積分數為0.7%的利塞膦酸水溶液的pH值約為2.0）；相對于酸性較強的利塞膦酸而言，其合成原料藥中的殘留物2-（3-吡啶）乙酸是一種非常弱的酸，因此要同時使利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸在離子對色譜中保留，并使利塞膦酸鈉與其有關化合物得到良好的分離，關鍵是選擇合適的pH值。當四丁基溴化銨濃度（6 mmol/L）、磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）及甲醇的體積分數（20%）一定時，流動相pH值在4.0～7.5時對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響見圖1A。

圖1 流動相對利塞膦酸鈉、2（-3-吡啶）乙酸的保留與分離的影響a.利塞膦酸鈉；b.2（-3-吡啶）乙酸Fig 1 Influences of the mobile phase on the retention and separation of RS and 2-（3-pyridine）acetic acida.RS；b.2（-3-pyridine）acetic acid

由圖1A可知，隨著流動相pH值的增加，利塞膦酸鈉、2-（3-吡啶）乙酸在柱上保留都增加；當pH≥7.0時，2-（3-吡啶）乙酸的保留因子k＞1，說明只有在較高pH條件下，2-（3-吡啶）乙酸才以陰離子狀態(tài)存在，從而可以與四丁基銨陽離子形成中性離子對，在C8柱上得到良好的保留。兼顧到合適的保留時間與良好的分離情況，最終選擇pH 7.0作為分離條件（當pH＞7.0時，流動相對C8柱的損害較大）。

（2）離子對試劑濃度的影響。當磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）、流動相pH值（7.0）及甲醇的體積分數（20%）一定時，離子對試劑四丁基溴化銨濃度為0～8 mmol/L時對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響見圖1B。

由圖1B可以看出，隨著四丁基溴化銨濃度的增加，二者的保留都呈現出增加的趨勢。當四丁基溴化銨濃度大于6 mmol/L時，利塞膦酸鈉保留增加趨于緩慢。同時四丁基溴化銨濃度的增加改善了利塞膦酸鈉峰形的拖尾，說明四丁基溴化銨也起到了減尾劑的作用?？紤]到利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸的保留行為和峰形情況，最終選擇四丁基溴化銨的濃度為6 mmol/L，在此條件下，二者分離良好，利塞膦酸鈉峰的拖尾因子為1.05。

（3）有機改性劑比例的影響。當四丁基溴化銨的濃度（6 mmol/L）、磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）及流動相pH值（7.0）一定時，加入體積分數為5%～25%的甲醇，考察其對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響，結果見圖1C。

圖1C結果表明，隨著甲醇體積分數的增加，流動相的極性減小，洗脫能力增強，利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸的保留均減弱。兼顧到合適的保留時間與分離情況，最終選擇甲醇的體積分數為20%。

（4）緩沖液濃度的影響。在6 mmol/L四丁基溴化銨及20%甲醇條件下，濃度為5～50 mmol/L的磷酸鹽（磷酸二氫鈉）緩沖液對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響見圖1D。

由圖1D可知，隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增加，二者的保留均減弱。為了保證良好的分離及合適的保留時間，最終選擇磷酸鹽緩沖液的濃度為5 mmol/L。

在上述試驗確定的優(yōu)化條件下，采用C8色譜柱，取利塞膦酸鈉對照品、2-（3-吡啶）乙酸對照品、注射用利塞膦酸鈉（批號：20110811）、利塞膦酸鈉注射液（批號：20120107）、經氧化破壞的利塞膦酸鈉注射液樣品（批號：20120107）及經紫外燈（40 W，照射6 d）照射后的利塞膦酸鈉注射液樣品（批號：20120107）水溶液進樣，結果見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.利塞膦酸對照品；B.2-（3-吡啶）乙酸對照品；C.注射用利塞膦酸鈉；D.利塞膦酸鈉注射液；E.氧化破壞后的利塞膦酸鈉注射液；F.紫外照射后的利塞膦酸鈉注射液；a.利塞磷酸鈉；b.2-（3-吡啶）乙酸；c～e.其他氧化分解產物Fig 2 HPLC chromatogramsA.control of RS；B.control of 2-（3-pyridine）acetic acid；C.RS for injection；D.RS injection；E.injection samples destroyed by oxidation；F.injection samples after ultraviolet radiation；a.RS；b.2-（3-pyridine）acetic acid；c-e.other products of oxidation and decomposition

由圖2可見，2-（3-吡啶）乙酸和利塞膦酸鈉的保留時間分別約為3.0、7.8 min，9 min內即可完成一次進樣分析；且利塞膦酸鈉與有關化合物的分離情況良好，與保留時間最接近的雜質峰的分離度大于2.5。

3 討論

雙膦酸類藥物（包括雙膦酸和雙膦酸鹽）是一類含有P-C-P鍵的化合物，含有2個膦酸基團，因而極性很強，不能在C8、C18等非極性色譜柱上保留，其色譜分析方法多采用離子交換HPLC法[1-8]。雙膦酸類化合物是四元酸，存在多級電離，在離子交換HPLC法中為了保證其以單一的電離形式保留，需要采用強堿或強酸性流動相，因而這些方法大多以價格昂貴的耐強堿或耐強酸的陰離子交換柱為固定相；且需要梯度洗脫，分離效果及重現性差，操作煩瑣耗時，分析成本高，難以在藥品的常規(guī)分析中應用。

本文建立的離子對RP-HPLC法，通過在流動相中加入離子對試劑四丁基溴化銨，使得利塞膦酸鈉及其有關物質在反相色譜柱上保留，并通過優(yōu)化色譜條件，采用等度洗脫方式便達到了很好的分離及含量測定效果；且方法可靠、簡單，不需要復雜的樣品處理過程，故適用于利塞膦酸鈉原料藥及其制劑的常規(guī)檢驗。

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