哮喘患兒外周血單個核細胞全基因組表達譜的差異研究*

孔 倩， 黃花榮， 吳葆菁， 李雯靜， 陳 純

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院兒科，廣東廣州510120)

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是氣道的慢性炎癥 性疾病，其發(fā)病機制主要為變應原作用于有遺傳傾向的特應性體質(zhì)，從而引起Th2型炎癥反應［1］。目前臨床上以聯(lián)合應用糖皮質(zhì)激素、β2受體激動劑、抗膽堿藥、白三烯受體拮抗劑等治療為主，但長期應用激素將帶來不少副作用，且激素往往不能很好控制嚴重病例，少數(shù)患者甚至對激素無效。因此基因防治倍受人們關注。但基因防治哮喘仍存在諸多局限，最突出的問題是治療靶向性不高。而全基因組表達譜芯片具有高通量、準確、高效等特點，能同時獲得數(shù)以萬計的基因活化模式，為臨床上明確病因機制、早期診斷、疾病分型分期、尋找治療靶點及提示預后等提供海量的信息［2］。因此，本研究擬通過全基因組芯片技術，分析哮喘患兒與對照組兒童的外周血單個核細胞基因表達譜的特征性改變，以期進一步明確哮喘的發(fā)病機制，尋找合適的治療靶點。

材料和方法

1 材料與儀器

淋巴細胞分離液Ficoll購自Sigma;Trizol購自Invitrogen;PCR試劑購自TaKaRa;PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成;Roche NimbleGen全基因組表達譜芯片(Homo sapiens 12×135K Array)由上?？党缮镉邢薰咎峁oche LightCycler 480實時熒光定量PCR儀。

2 研究對象

選取2011年11月至2012年4月在中山大學附屬孫逸仙紀念醫(yī)院兒科綜合區(qū)住院的哮喘患兒5例為病例組(A組)，其中男3例，女2例，中位年齡3.17(1．96～3．96)歲。病例組患兒需符合以下全部入組標準:(1)年齡＜14周歲;(2)符合2008年《兒童支氣管哮喘診斷及防治指南(修訂版)》中的哮喘診斷標準;(3)血清總IgE高于同年齡組正常范圍;(4)皮膚點刺實驗陽性。由于入組患兒年齡均較小，故未行肺功能檢測及支氣管激發(fā)實驗。

選取同期小兒外科病區(qū)待行包皮環(huán)切術、腹部疝修復術等住院患兒5例為對照組(簡稱N組)，其中男3 例，女2 例，中位年齡 2．80(1．90 ～3．52)歲。需要符合以下全部入組標準:(1)年齡＜14周歲;(2)無過敏性疾病病史及癥狀(包括喘息、變應性鼻炎、特應性皮炎等);(3)血清總IgE在同年齡組正常范圍內(nèi);(4)無哮喘家族史。

排除標準包括:(1)年齡≥14周歲;(2)發(fā)熱(腋下體溫＞37．4℃);(3)C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)＞5 g/L和(或)降鈣素原(procalcitonin，PCT)陽性;(4)既往30 d內(nèi)使用過任何制劑的糖皮質(zhì)激素藥物;(5)任何急性感染或其它主要疾病。

2組兒童在年齡分布和性別構成上無明顯差異(P＞0．05)。本研究獲得中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準，嚴格遵循倫理學標準，并征得全部患兒或父母的知情同意。

3 方法

3．1 標本采集 所有研究對象入院后，于治療前分別采集外周靜脈血4～5 mL，肝素鈉抗凝，存于4℃冰箱。4 h內(nèi)分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

3．2 PBMC分離、儲存 等量PBS稀釋血標本，然后按稀釋血∶Ficoll=1∶2，在Ficoll液面上加入稀釋血標本，20℃、2 000 r/min離心30 min。吸取單核細胞層到新離心管，加等量PBS重懸混勻，20℃ 1 200 r/min離心10 min。棄上清，2～3 mL PBS重懸混勻后進行細胞計數(shù)。余下的細胞懸液，20℃、800 r/min離心8 min，棄上清，每106個細胞加1 mL Trizol，存于 －80 ℃。

3．3 總RNA的提取及質(zhì)檢 取出Trizol凍存的細胞，解融后室溫靜置5min，每1 mL Trizol加入0．2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心15min，取上層無色水，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇洗滌，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清。靜置干燥后，加入20～30μL DEPC水。提取的RNA樣本均進行紫外分光光度計濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

3．4 cDNA探針的合成和標記、芯片的雜交、洗滌、掃描 本研究選用Roche NimbleGen全基因組表達譜芯片，芯片實驗由上?？党缮镉邢薰就瓿?。

3．5 基因芯片實驗結果的熒光定量PCR(qRTPCR)驗證 為驗證芯片結果的可靠性，在10例RNA 樣本中，針對 ADAM33、TNFSF14、Smad7、TNFSF13等4個基因和看家基因GAPDH，進行qRTPCR驗證，引物序列見表1。取上述提取的RNA 500 ng，逆轉錄合成 cDNA。取 cDNA 2μL，每個樣本3個復孔，終體積20μL，使用Quant SYBR Green PCR kit進行qRT-PCR。PCR反應條件:(1)預變性95℃ 30 s，20℃/s 1個循環(huán);(2)PCR反應95℃ 5 s，20℃/s;65℃ 30 s，20℃/s 40個循環(huán);(3)熔解曲線分析95℃ 0 s，20℃/s，1個循環(huán);65 ℃ 15 s，20℃/s;95 ℃ 0 s，0．1 ℃ /s。以 GADPH 為內(nèi)參照，用ΔCt法比較各樣品基因的表達水平，繪制擴增曲線和熔解曲線，對照組基因表達量設為1，計算各樣品基因相對表達量。

表1 引物序列Table 1．Sequences of the primers

3．6 生物學信息分析 芯片所有探針信號經(jīng)均一化處理后，計算基因表達差異倍數(shù)。判斷基因表達差異應同時符合以下標準:(1)P≤0．05;(2)基因表達差異變化≥2倍，即≥2為上調(diào)基因，≤0．5為下調(diào)基因。利用 GenePix Pro 6．0、NimbleScan 2．6、Agilent GeneSpring GX 11．5．1、MultiExperiment Viewer 4．8．1、DAVID Bioinformatics Resources 6．7(http://david．a(chǎn)bcc．ncifcrf．gov/)等進行圖形及數(shù)據(jù)分析。

4 統(tǒng)計學處理

非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，計數(shù)資料用百分率或比表示;符合正態(tài)分布的兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 病例資料特點

病例組及對照組病例資料特點見表2。

表2 病例資料特點Table 2．Characteristics of the cases

2 RNA質(zhì)控

紫外分光光度計濃度測定結果顯示，所有RNA樣本的A260/A280比值在1．8～2．2之間，無 DNA或蛋白質(zhì)殘留，純度較高。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，各標本的電泳圖28S、18S和5S條帶清晰明亮，無拖尾或彌散，且28S的亮度約為18S的2倍，說明RNA無降解，完整性較好，見圖1。

3 芯片雜交結果

芯片掃描結果顯示芯片信號強度均一、清晰，背景值均勻，結果可靠。繪制各組信號值的散點分布圖，大部分基因位于Fold Change Lines以內(nèi)，其差異無統(tǒng)計學意義。少數(shù)偏離Fold Change Lines，則為差異表達基因，見圖2。

4 芯片數(shù)據(jù)篩選及層次聚類分析

按照設定的差異表達基因篩選標準，對兩組樣本進行非配對t檢驗，篩選出差異表達基因795個，其中未命名的基因37個，功能未明確的基因132個。已命名的758個基因中，上調(diào)基因345個，下調(diào)基因413個。已明確功能的626個基因中，上調(diào)241個，下調(diào)385個。基于全部795個差異表達基因的層次聚類分析結果提示，10例樣本被聚為兩大類，與病例組和對照組的區(qū)分一致，見圖3。

已命名的758個差異表達基因中檢索到40個基因與哮喘、氣道炎癥或氣道重構有關，其中29個基因的變化趨勢與文獻報道一致，包括14個上調(diào)基因和15個下調(diào)基因。針對這29個相關基因(共31個轉錄本)進行層次聚類分析，10例樣本被聚為兩大類，與病例組、對照組的區(qū)分完全一致。31個基因轉錄本被劃分為兩大類，與上調(diào)、下調(diào)的區(qū)分完全一致。上調(diào)基因被聚為4類，下調(diào)基因則聚為5類，見圖 4、表 3。

Figure 1．The integrity of RNA tested by denaturing agarose gel electrophoresis．1 ～5:group N;6 ～10:group A．圖1 變性瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性

Figure 2．Scatter plot of gene expression．Genes above the top green line and below the bottom green line indicated more than 2-fold change of genes between group N and group A．圖2 基因表達散點圖

Figure 3．Excerpts of the hierarchical cluster analysis based on 795 differentially expressed genes．圖3 基于795個差異表達基因的層次聚類分析圖(節(jié)選)

Figure 4．Hierarchical cluster analysis based on 29 differentially expressed asthma-related genes(31 transcripts)．圖4 基于29個哮喘相關差異表達基因(31個轉錄本)的層次聚類分析圖

5 Gene Ontology功能分類分析

利用 DAVID Bioinformatics Resources 6．7，從758個已命名的基因中可得到614個基因注釋，含上調(diào)基因237個，下調(diào)基因377個。其余144個基因主要為功能未明確的基因或相同基因的不同轉錄本。針對這614個基因進行Gene Ontology功能分類分析，我們發(fā)現(xiàn)在生物學過程(biological process)方面，這些差異表達基因主要與免疫反應、對外部刺激的反應、信號轉導及分子功能的負性調(diào)節(jié)、細胞死亡、凋亡及其調(diào)節(jié)等有關，見表4。在細胞成分方面，差異基因主要與血小板α顆粒、囊泡腔、細胞外間隙、細胞膜表面等有關。在分子功能方面，主要與蛋白水解酶活性、蛋白結合、激酶活性、轉錄抑制物活性、催化活性等密切相關。

6 基因芯片結果的qRT-PCR驗證

選取了Smad7、腫瘤壞死因子配體超家族成員13(tumor necrosis factor ligand superfamily member 13，TNFSF13)、解整合素樣金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase domain 33，ADAM33)和腫瘤壞死因子配體超家族成員14(tumor necrosis factor ligand superfamily member 14，TNFSF14)共4個基因，分別以GADPH為對照，針對兩組共10例樣本進行qRT-PCR檢測。Smad7和TNFSF13在實驗組表達下調(diào)，在對照組高表達;ADAM33和TNFSF14在實驗組表達上調(diào)，在對照組低表達，見圖5。上述qRT-PCR結果與芯片結果一致，提示基因芯片結果可靠。

表3 29個哮喘相關基因(31個轉錄本)的潛在基因功能Table 3．Potential functions of 29 asthma-related genes(31 transcripts)

討 論

哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病。其發(fā)生機制復雜，大量流行病學及分子遺傳學證據(jù)已表明，哮喘是由環(huán)境和遺傳因素相互作用而形成的多基因遺傳病，不少基因［2］或基因多態(tài)性［3-4］已證實在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。全基因組表達譜芯片作為一種高通量、快速、平行的基因表達信息分析技術，能高效獲取海量信息，適合大規(guī)?；虮磉_譜的分析，已用于多種疾病的相關基因篩選［5-7］。

近年來，學者們把芯片技術應用于小鼠［8］、馬［9］或靈長類動物［10］的哮喘模型，或在臨床研究中采用鼻黏膜細胞［11］、誘導痰［12］、纖支鏡獲取成人呼吸道上皮細胞［13］作為樣本，篩選出與哮喘關系密切的差異基因。但上述臨床研究主要針對成人哮喘患者，活檢獲取樣本費用高、不適于兒童患者，而且取材部位各異，對實驗結果干擾較大。而外周血細胞存在獨特的基因表達譜型，能反映人體組織穩(wěn)定的(遺傳)和動態(tài)的(環(huán)境和疾病影響)變化［14］。目前公認哮喘是一種全身性疾病，哮喘患者的外周血淋巴細胞呈現(xiàn)高活性、高基因表達變化的特點。因此，本研究利用芯片技術分析外周血單個核細胞的基因變化，所選用的Roche NimbleGen全基因組表達譜芯片，含有45 033個基因，平均每個基因設計了3個長寡核苷酸探針，具有更可靠的統(tǒng)計學意義。層次聚類分析結果也顯示，10個樣本被劃分為兩類，與哮喘患兒及對照組兒童的分組完全一致;差異基因也被區(qū)分為兩大類，與上調(diào)、下調(diào)的區(qū)分也完全一致，均說明了芯片篩選外周血單個核細胞所得到的差異表達數(shù)據(jù)靈敏、可信，對后續(xù)深入研究有較高參考意義。

表4 差異基因的生物學過程分類Table 4．The biological process classification of differential genes

Figure 5．Expression of 4 differentially expressed genes verified by qRT-PCR．Mean ± SD．n=5．*P ＜ 0．05 vs group N．圖5 qRT-PCR驗證芯片結果

本研究針對29個哮喘、炎癥、氣道重構等相關基因進行層次聚類分析，上調(diào)基因被聚為4類，下調(diào)基因則歸為5類。同時Gene Ontology功能分類結果顯示，在生物學過程方面，差異表達基因主要與免疫反應、對外部刺激的反應、信號轉導及分子功能的負性調(diào)節(jié)、細胞死亡、凋亡及其調(diào)節(jié)等有關。層次聚類中被歸為同一類的基因具有相似的表達變化模式，因此以同類基因已知功能為出發(fā)點，可為功能尚未完全闡明的基因提供線索和思路，從而明確這些基因在哮喘中發(fā)揮的作用。

Smad家族是直接參與TGF-β信號轉導的蛋白，其家族成員功能復雜，既促進Th17和Th9相關的免疫反應，也通過抑制Th1、Th2、B細胞和CTLs分化或促進Treg細胞功能來抑制機體免疫反應，還通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)來參與氣道重構。Smad7是位于胞內(nèi)的I-Smad抑制型蛋白，可被TGF-β家族激活，并負向調(diào)控TGF-β信號轉導，但具體機制及其在哮喘中發(fā)揮的作用尚未完全闡明。Luo等［15］通過過表達上皮細胞的Smad7，特異性阻斷TGF-β信號，從而緩解哮喘癥狀。Crosby 等［16］和 Willis等［17］發(fā)現(xiàn) Smad7可抑制TGF-β1，通過阻斷上皮細胞間質(zhì)轉型(EMT)來逆轉氣道重構。Shi等［18］則發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道上皮的Smad7水平與基底膜厚度及氣道高反應性呈負相關。本研究的數(shù)據(jù)也顯示，Smad7在實驗組明顯下降，提示Smad7很可能是哮喘的易感基因，有必要深入探討TGF-β/Smad信號通路的機制，提高患兒的Smad7水平有望成為哮喘防治的有效策略。

TNFSF13(又名APRIL)是TNF超家族成員，參與B細胞的發(fā)育、類別轉換、IgE的產(chǎn)生以及T細胞活化、增殖。針對TNFSF13在哮喘中的作用，研究結果不一。Moon 等［19］和 Bilsborough 等［20］發(fā)現(xiàn)抑制TNFSF13可減輕氣道炎癥及高反應性，并改善肺功能及減少糖皮質(zhì)激素用量。然而，Xiao等［21］發(fā)現(xiàn)TNFSF13缺陷小鼠在哮喘誘導過程中表現(xiàn)為強烈炎癥反應。BAFF則是TNF超家族中另一成員，其結構、分布、受體及生物學功能均與TNFSF13高度類似。Sutherland等［22］研究發(fā)現(xiàn) BAFF能抑制 Th2介導的氣道炎癥，間接提示TNFSF13很可能具有類似作用。而在本研究的數(shù)據(jù)分析中，哮喘患兒外周血TNFSF13比對照組兒童下調(diào)2．71倍。雖然 TNFSF13在哮喘中的作用尚存爭議，但其對機體免疫功能的顯著影響提示TNFSF13與哮喘發(fā)病密切相關，很可能成為哮喘的治療靶點。

ADAM33是與細胞增殖、分化、黏附、信號轉導及凋亡相關的跨膜蛋白，主要分布在氣道平滑肌及肺成纖維細胞，與氣道重構、氣道高反應性及IgE水平相關。Lee等［23］發(fā)現(xiàn)成年哮喘患者肺泡灌洗液中ADAM33水平與肺功能呈負相關。Foley等［24］發(fā)現(xiàn)中重度哮喘患者的支氣管活檢樣本中ADAM33明顯高于輕度哮喘及正常人群。Jie等［25］的數(shù)據(jù)表明在肺成纖維細胞中ADAM33受Th2的正向調(diào)控，并在小鼠哮喘模型中表現(xiàn)為明顯的上皮下膠原沉積及氣道縮窄。本研究芯片數(shù)據(jù)也顯示，ADAM33在哮喘患兒組顯著升高2．6倍。ADAM33作為哮喘的易感基因，其致病機制及調(diào)控網(wǎng)絡并未闡明。深入研究ADAM33，對于改善難治性哮喘或反復哮喘所致氣道重構有深遠意義。

TNFSF14(又稱LIGHT)是TNF家族配體，其受體為LTβR和 HVEM。Hastie等［26］的數(shù)據(jù)顯示242例不同程度哮喘患者痰樣本中的TNFSF14與肺功能呈負相關。Doherty等［27］認為TNFSF14是通過結合LTβR上調(diào) TGF-β 水平，或結合 HVEM 上調(diào) IL-13，從而導致氣道重構。TNFSF14結合HVEM后還可刺激血管平滑肌細胞的增殖，TNFSF14-LTβR也能上調(diào)α-平滑肌肌動蛋白增殖，平滑肌細胞的畸形生長能導致肺功能下降，與重癥或難治性哮喘有關。本研究發(fā)現(xiàn)TNFSF14在實驗組明顯上調(diào)。因此有必要進一步研究TNFSF14的致病機制，阻斷TNFSF14與LTβR或HVEM的結合很可能成為改善氣道纖維化、逆轉氣道重構的可行策略。

哮喘發(fā)病機制復雜，具體機制尚未完全闡明。本研究利用全基因組表達譜芯片，分析哮喘患兒與對照組兒童的外周血單個核細胞的特征性基因改變，并初步篩選出與哮喘、氣道炎癥、氣道重構等有關的差異基因，但篩選適合作為臨床哮喘防治靶點的基因有待進一步的數(shù)據(jù)挖掘和分析。