妊娠晚期流感病毒感染對后代小鼠肺發(fā)育的影響*

張 鈺， 韋 紅， 周劍芳， 于在江， 舒躍龍△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心，重慶400014;2中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，病毒基因工程國家重點實驗室，北京100052)

既往流感大流行［1］以及季節(jié)性流感［2］統(tǒng)計資料顯示，相對于正常非孕婦女，孕婦感染流感病毒后更易發(fā)展為重癥病例甚至死亡。孕期感染流感病毒對母親及發(fā)育中的胎兒均可造成負(fù)面影響，增加孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險性［1］。此外，孕婦感染流感病毒后機體免疫狀態(tài)與宮內(nèi)微環(huán)境的改變，可損害發(fā)育中胎兒的器官結(jié)構(gòu)或功能，目前此方面的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)［3］，國內(nèi)外尚無孕期流感病毒感染對后代肺發(fā)育影響的報道。

肺表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和無纖毛的支氣管與細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(Clara細(xì)胞)分泌的磷脂類和蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，具有降低肺泡表面張力、防止呼氣末肺萎陷的重要作用［4］。肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)-B、-C在肺表面活性物質(zhì)吸附于肺泡氣－液交界面從而發(fā)揮其生理活性的過程中起關(guān)鍵作用，其合成和分泌受發(fā)育階段、激素水平以及環(huán)境因素的調(diào)節(jié)［5］。本研究旨在探討在肺發(fā)育的重要時期母親流感病毒感染對后代小鼠肺組織形態(tài)以及SP-B和SP-C蛋白表達的影響。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 孕15 d SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1．2 病毒 本研究所用病毒為流感病毒A/四川/SWL1/2009 H1N1(簡稱 SC/1)，血凝滴度為128，病毒 TCID50為10－6．95/mL。該病毒分離自中國內(nèi)地首例2009甲型H1N1流感病例，由國家流感中心分離保存。為消除孕鼠死亡、流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、早產(chǎn)等偏倚因素對實驗結(jié)果的影響，本研究選擇非致死量病毒稀釋液感染孕鼠。

1．3 藥品與主要試劑 小鼠SP-B單克隆抗體(Abcam);兔SP-C多克隆抗體(Santa Cruz);小鼠βactin單克隆抗體(Bioworld);山羊抗兔 IgG抗體(KPL);兔抗小鼠IgG抗體(KPL)?？偟鞍滋崛≡噭┖?南京凱基公司);8% ～16%Tris-Gly預(yù)制膠(Invitrogen)。

1．4 主要儀器 Olympus BX51顯微鏡，ChemiDoc XRS圖像采集系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2．1 動物分組與處理 將孕15 d小鼠隨機分為對照組和感染組，每組8只。異氟烷輕度麻醉后，予對照組25μL滅菌PBS滴鼻;予感染組25μL SC/1病毒稀釋液(稀釋至10－3)滴鼻感染。移去分娩后的感染組孕鼠，以正常哺乳期BALB/c小鼠作為代母鼠，防止甲流感染母鼠哺乳對小鼠造成的不良影響。

2．2 標(biāo)本收集與處理 小鼠出生當(dāng)天記為P0。分別從各組隨機抽取P0、P4、P7和P14小鼠各10只，腹腔注射10% 水合氯醛(0．3 mL/g)麻醉。剖開胸腔，迅速切取右肺，液氮速凍后凍存于－80℃冰箱用于Western blotting檢測;取左肺放入多聚甲醛固定液中，制作石蠟切片(厚度約4μm)。

2．3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 每例標(biāo)本取連續(xù)的石蠟切片2張，蘇木素－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組鼠的肺組織病理學(xué)改變。每張切片隨機取不重疊的5個視野(×200)，以10個視野的輻射狀肺泡計數(shù)(radial alveolar counting，RAC)和肺泡隔厚度的均值作為該例標(biāo)本的相應(yīng)指標(biāo)測定值。RAC測定參照文獻［6］。

2．4 檢測肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量 做SP-C的免疫組化染色，陽性細(xì)胞即為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。采用免疫組化SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10～15 min，0．01 mol/L pH 6．0枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)抗原，正常山羊血清室溫封閉非特異性抗原20～30 min;滴加兔抗小鼠SP-C多克隆抗體(抗體稀釋度為1∶100)，4℃冰箱孵育過夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育30 min;DAB顯色1～2 min;蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片后光鏡下觀察。以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性表達，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。每例標(biāo)本取2張連續(xù)的石蠟切片，光鏡下(×400)每張切片隨機選取5個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件進行分析，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，最后取10個視野的平均值作為該例標(biāo)本的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量。

2．5 Western blotting檢測肺組織SP-B和SP-C 按蛋白提取試劑盒說明書，提取肺組織總蛋白，BCA法蛋白定量。選擇β-actin作為內(nèi)參照;蛋白變性后取10μL待測蛋白按序加樣電泳;電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。TBS液4℃封閉過夜;分別加入Ⅰ抗(小鼠SP-B單克隆抗體，1∶100;兔 SP-C 多克隆抗體，1∶200)37 ℃孵育2 h;分別加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(兔抗小鼠IgG抗體，1∶5 000;山羊抗兔 IgG 抗體，1∶5 000)37 ℃孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，ChemiDoc XRS圖像采集系統(tǒng)采集圖像，采用Quanty One 4．62進行圖像分析后作蛋白相對表達量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS13．0軟件包進行統(tǒng)計分析。對照組和感染組間的比較用t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

用非致死量流感病毒稀釋液滴鼻感染孕鼠后，孕鼠從第2天開始逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、精神不振、豎毛、弓背及呼吸急促等癥狀，孕鼠無死亡。無流產(chǎn)、死產(chǎn)或早產(chǎn)。對照組和感染組小鼠出生胎齡分別是(20．50 ±1．08)d和(20．40 ±1．17)d，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;每窩出生小鼠數(shù)分別是5．50±0．85和5．40±0．97，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。觀察期內(nèi)后代小鼠無死亡，未見唇周發(fā)紺、氣促、呼吸困難等癥狀。

2 小鼠體重和肺組織重量的變化

隨日齡增加，對照組小鼠體重和肺組織重量逐漸增加。感染組小鼠出生體重明顯減輕［(1．24±0.20)g vs(1．66 ±0．23)g］，其體重雖隨日齡增加呈增加趨勢，但P4、P7和P14體重仍較對照組小鼠輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。感染組小鼠肺組織重量在各時點均比對照組小鼠稍重，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 各組小鼠體重和肺組織重量比較Table 1．Body weight and lung weight of the offsprings(g．Mean±SD．n=10)

3 肺組織病理學(xué)改變

對照組小鼠隨鼠齡增加肺組織發(fā)育逐漸成熟，RAC逐漸增多;肺泡間隔厚度逐漸變薄。感染組小鼠肺間質(zhì)輕度充血、水腫，局灶性肺泡隔增寬，RAC明顯減少(P＜0．05)。SP-C免疫組化染色計數(shù)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，對照組和感染組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、2和表2。

Figure 1．The pathological changes of lung tissues in offspring mice(HE staining， × 200)．A:control group，no significant pathological changes;B:infection group，focal alveolar septal widening with pneumocyte hyperplasia and alveolar cell degeneration．圖1 各組小鼠肺組織的典型病理學(xué)改變

Figure 2．Surfactant protein C immunohistochemical staining of lung tissues in offspring mice(SP，×400)．A:control group;B:infection group．圖2 各組小鼠肺組織SP-C的免疫組化染色

表2 各組小鼠RAC和肺泡隔厚度比較Table 2．Radial alveolar counting and thickness of alveolar diaphragm in each group(mean±SD．n=10)

4 肺組織SP-B和SP-C蛋白表達的變化

對照組小鼠肺組織SP-B的表達在P0較高，之后呈逐漸降低的趨勢;SP-C的表達在P0～P7呈升高趨勢，在P7～P14呈下降趨勢。與對照組相比，感染組小鼠肺組織SP-B的表達在P0較低，在其它各時點明顯升高;SP-C的表達水平在P0較高，但在P4、P7和 P14均明顯降低(P ＜0．05)，見圖3。

討 論

母親孕期感染流感病毒可對發(fā)育中的胎兒造成不良影響。本研究結(jié)果顯示妊娠晚期流感病毒感染可造成胎兒的低出生體重(較對照組減輕約23%～27%)，與 Mendez-Fiqueroa等［7］的報道一致。低出生體重是胎兒宮內(nèi)生長受限的標(biāo)志，是不良宮內(nèi)微環(huán)境的反映，引起胎兒宮內(nèi)生長受限最常見的原因是胎盤功能障礙［8］。Fatemi等［9］研究發(fā)現(xiàn)孕期流感病毒感染可引起胎盤組織結(jié)構(gòu)和多種基因表達異常，說明母親孕期感染流感病毒可能造成胎盤功能障礙，不能向發(fā)育中的胎兒輸送足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響胎兒生長發(fā)育。此外我們研究發(fā)現(xiàn)，直至P14感染組小鼠體重仍較對照組輕，提示母親妊娠晚期感染流感病毒不僅影響胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育，而且對其出生后的體格生長仍有深遠(yuǎn)影響。

導(dǎo)致胎兒體格生長受限的因素也可能同樣地對發(fā)育中的肺組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負(fù)面影響，從而影響胎兒生后的肺功能［10］。在本研究中，感染組小鼠肺間質(zhì)充血、水腫;局灶性肺泡隔增厚，這些病理改變可能是小鼠肺組織重量輕度增加的原因;此外感染組小鼠肺泡發(fā)育程度較低，評價肺泡發(fā)育程度的重要指標(biāo)RAC在各時點均明顯減少，提示孕期流感病毒感染干擾了后代正常的肺發(fā)育進程。

肺表面活性蛋白的合成與分泌受肺發(fā)育過程中多種復(fù)雜因素的調(diào)控，是肺發(fā)育成熟與否的重要標(biāo)志之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨日齡增加，對照組小鼠肺組織SP-B和SP-C的表達呈動態(tài)變化，提示二者與肺發(fā)育過程密切相關(guān)。與對照組相比，感染組小鼠肺組織SP-B的表達在P0降低，而在其它檢測時點明顯升高，尤以P7升高明顯;SP-C的表達在P0升高，但在其它各時點顯著降低。感染組小鼠SP-B和SPC在P0的表達模式變化可能是呼吸建立的刺激及適應(yīng)出生后呼吸功能需要的結(jié)果。SP-B表達從P4開始呈增高趨勢，而小鼠肺泡化過程從P3開始［11］，提示在孕期流感病毒感染造成后代小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞的情況下，可能通過上調(diào)肺組織內(nèi)和肺發(fā)育相關(guān)的物質(zhì)如SP-B，以在肺泡化的關(guān)鍵時期發(fā)揮代償作用，增加肺泡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，維持肺的容積，試圖使肺結(jié)構(gòu)或功能恢復(fù)正常。這種代償作用在早期短時間內(nèi)表現(xiàn)活躍，至P7出現(xiàn)SP-B的表達高峰，之后SP-B表達雖仍較對照組升高，但漸呈下降趨勢，說明這種代償作用是有限的。

SP-C是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的特異分化標(biāo)志物，本研究中我們發(fā)現(xiàn)母親孕期流感病毒感染并未影響其后代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的數(shù)量，因此SP-C表達的減少提示生前病毒感染影響了SP-C合成或分泌的環(huán)節(jié)。研究資料顯示SP-C合成與分泌減少可導(dǎo)致肺泡上皮變性、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑及纖維化等多種肺組織非特異性病理改變［12］，與多種兒童呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［13］。然而我們在研究過程中未見感染組小鼠死亡，且無氣促、呼吸困難等表現(xiàn)，可能是SP-C減少的程度尚不足以引起呼吸功能障礙，也可能是SP-B表達上調(diào)對呼吸功能代償性調(diào)節(jié)的結(jié)果。妊娠晚期流感病毒感染引起的后代小鼠SP-B和SP-C表達模式變化是否會對肺組織結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，以及其具體的影響機制是我們下一步研究的重點。

Figure 3．Western blotting analysis of SP-B and SP-Cprotein expression in lung tissues．A:control group;B:infection group．Mean ± SD．n=10．*P ＜0．05 vs A．圖3 肺組織SP-B、-C蛋白相對表達水平分析