硫化氫在休克腸淋巴液致肝損傷中的作用與機(jī)制*

韓 波， 張立民， 陳立鋒， 趙自剛， 李曙光△， 牛春雨△

(1河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，河北張家口075029;2內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000)

肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，在機(jī)體新陳代謝中發(fā)揮重要作用。創(chuàng)傷、失血、內(nèi)毒素等嚴(yán)重致病因素引起的肝損傷，成為多器官衰竭發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［1-4］。近年來(lái)，學(xué)者們開(kāi)始關(guān)注淋巴系統(tǒng)與危重病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，認(rèn)為危重狀態(tài)下的腸淋巴液回流是導(dǎo)致機(jī)體重要器官結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙的關(guān)鍵因素［5-6］。我們的研究也表明，阻斷腸淋巴液回流可減輕失血－脂多糖、重癥失血性休克大鼠肝臟的組織學(xué)損傷［7-9］，其機(jī)制還有待深入研究。研究表明，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種內(nèi)源性氣體分子，在炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化還原狀態(tài)等方面具有多種生物學(xué)活性［10］，參與了失血性休克和內(nèi)毒素休克后的炎癥反應(yīng)以及器官損傷［11-12］。H2S引起的炎癥反應(yīng)是否與腸淋巴液回流導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷有關(guān)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)詳細(xì)的報(bào)道。為此，本研究應(yīng)用H2S合成酶胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)抑制劑 DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)和 H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)作用于行腸淋巴液引流的大鼠，探討H2S在腸淋巴液引流減輕休克大鼠肝損傷中的作用，結(jié)合Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10、IL-12 和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的變化，探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物與處理

30只健康、清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(軍)2007-004］，體質(zhì)量220～260 g。大鼠經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)均分為:假手術(shù)組(sham)、休克組(shock)、休克+引流組(shock+drainage)、休克+引流+PPG組(shock+drainage+PPG)和休克+引流+NaHS組(shock+drainage+NaHS)。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。休克+引流+PPG組大鼠于放血前0．5 h腹腔注射 PPG(Sigma，45 g/L，45 mg/kg)，休克+引流+NaHS組大鼠于放血前0．5 h腹腔注射 NaHS(Sigma，28 mmol/L，28 μmol/kg)，PPG和NaHS所用劑量參考文獻(xiàn)［13-14］;假手術(shù)組、休克組和休克+引流組大鼠于放血前0．5 h或相當(dāng)時(shí)點(diǎn)腹腔注射與另外2組等量的生理鹽水(1 mL/kg)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 復(fù)制失血性休克模型

大鼠經(jīng)乙醚誘導(dǎo)麻醉后，肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，德國(guó)/北京化學(xué)試劑公司分裝)全身麻醉，休克組、休克+引流組、休克+引流+PPG組和休克+引流+NaHS組大鼠復(fù)制失血性休克模型［15-16］:(1)股部手術(shù)，分離股靜脈和股動(dòng)脈，右側(cè)股靜脈注射肝素鈉(1 mL/kg，500 U/kg)全身抗凝后，連接WZF-250F2型輸液泵(浙大醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，備輸液;右側(cè)股動(dòng)脈插管連接RM6240 BD型生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean artery pressure，MAP);左側(cè)股動(dòng)脈連接 NE-1000型抽注機(jī)(New Era Pump Systems)，備放血;(2)腹部正中線作長(zhǎng)4 cm縱切口，打開(kāi)腹腔，輕輕推開(kāi)腸管，暴露腸系膜根部，游離腸系膜上動(dòng)脈，仔細(xì)分離與腸系膜上動(dòng)脈相伴行的腸淋巴管;(3)術(shù)畢穩(wěn)定30 min后，自股動(dòng)脈勻速放血至40 mmHg，10 min完成;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以調(diào)整放血量維持血壓在(40±2)mmHg水平，60 min;(4)通過(guò)股靜脈緩慢回輸放出血液及林格氏液(1∶1)，30 min完成;(5)休克+引流組、休克+引流+PPG組和休克+引流+NaHS組在低血壓60 min、輸液30 min結(jié)束后，用一次性采血針插入腸淋巴管，引流腸淋巴液。休克組動(dòng)物僅剝離腸淋巴管，假手術(shù)組動(dòng)物僅進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但不放血，不輸液，不引流腸淋巴液，觀察至與其它各組相對(duì)應(yīng)的時(shí)點(diǎn)。各組大鼠在輸液結(jié)束后3 h或相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，留取大鼠肝臟，用于下述指標(biāo)的檢測(cè)。

3 檢測(cè)血漿生化指標(biāo)

應(yīng)用7600-110型全自動(dòng)生化分析儀(日立)，采用速率法檢測(cè)血漿天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和總膽汁酸(total bile acid，TBA)。

4 觀察肝組織形態(tài)

選擇固定位置肝組織，以4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，常規(guī)方法制備組織切片，光鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化，并拍片。

5 檢測(cè)肝組織H 2S含量

用不同濃度的NaHS標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其直線回歸方程為:y=1532．5x+6．786，R2=0．995。選擇固定位置肝組織，常規(guī)方法制備10%組織勻漿，檢測(cè)H2S含量:在玻璃試管中加入10 g/L醋酸鋅0．5 mL后，加入肝勻漿0．1 mL，振蕩搖勻，再依次加入20 mmol/L對(duì)苯二胺鹽酸鹽0．5 mL和30 mmol/L三氯化鐵0．5 mL，室溫孵育20 min，再加入1 mL 10%三氯醋酸使蛋白沉淀，最后以蒸餾水補(bǔ)足5 mL，充分混勻后，6 000 r/min離心5 min，吸上清液，用722分光光度計(jì)在670 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，應(yīng)用H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2S含量(μmol/L)。考馬斯亮藍(lán)法定量肝勻漿總蛋白，肝勻漿H2S含量以μmol/(g protein)表示。

6 檢測(cè)肝組織CSE含量

應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒(抗體由R＆D生產(chǎn)、江蘇鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司合成)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0．227x －0．028x2+0．003x3，R2=0．9987)后，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)各組肝組織勻漿CSE的含量。

7 檢測(cè)肝組織炎癥因子含量

應(yīng)用ELISA法檢測(cè) TLR4、IL-10、IL-12和 TNF-α。TLR4標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.058x+0.005x2+0.00021x3，R2=0.9958;IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.025x+0.0004x2－ 0.00000083x3，R2=0.9989;IL-12 標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.023x+0.003x2－0.00004x3，R2=0.9986;TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=1.003x+0.0001x2+0.00000032x3，R2=0.9991。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P＞0．10)的資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊(P≤0.10)的資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肝組織H 2S含量的變化

休克組大鼠肝組織H2S含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01);休克+引流組大鼠肝組織H2S含量與休克組相比出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，有顯著差異(P＜0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.01);加入PPG的休克+引流+PPG組大鼠肝組織H2S含量顯著下降，低于休克組與休克+引流組(P＜0.05或P＜0.01);而加入NaHS的休克+引流+NaHS組大鼠肝組織H2S含量顯著高于假手術(shù)組和休克+引流組(P ＜0.05，P ＜0.01)，達(dá)到休克組水平，見(jiàn)圖1。

Figure 1．Changes of hydrogen sulfide(H2 S)in rat liver tissues．Mean ± SD．n=6．＊＊P ＜ 0.01 vs sham group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs shock group;△P＜0.05 vs shock+drainage group．圖1 各組大鼠肝組織H 2S含量的變化

2 各組大鼠肝組織CSE含量的變化

休克組大鼠肝組織CSE含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);休克+引流組、休克+引流+PPG組和休克+引流+NaHS組大鼠肝組織CSE含量均顯著低于休克組(P＜0.01)，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖 2。

Figure 2．Changes of cystathionine γ-lyase(CSE)in rat liver tissues．Mean±SD．n=6．*P ＜ 0.05 vs sham group;##P ＜0.01 vs shock group．圖2 各組大鼠肝組織CSE含量的變化

3 各組大鼠肝功能生化指標(biāo)的變化

休克組大鼠血漿AST、ALT和TBA水平顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，休克 +引流組大鼠血漿AST、ALT和TBA水平顯著低于休克組(P＜0.05)，加入PPG的休克+引流+PPG組血漿AST、ALT和TBA水平顯著低于休克+引流組(P＜0.05或P＜0.01)，而加入NaHS的休克+引流+NaHS組血漿AST和 ALT水平顯著高于休克 +引流組(P＜ 0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝功能生化指標(biāo)的變化Table 1．Changes of biochemical indexes of hepatic functions in rats(Mean±SD．n=6)

4 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠肝索呈放射狀排列，血竇寬度基本正常，肝細(xì)胞核圓、核仁明顯、核膜清晰，可見(jiàn)雙核，胞漿染色嗜酸、均質(zhì)，見(jiàn)圖3A、B;休克組大鼠肝細(xì)胞排列稍紊亂，部分水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，見(jiàn)圖3C、D;休克+引流組肝細(xì)胞排列稍紊亂，核大小一致、圓形、居中，核膜清晰，見(jiàn)圖3E、F;休克+引流+PPG組肝索排列及肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，肝小葉周邊細(xì)胞可見(jiàn)輕度水腫，見(jiàn)圖3G、H;休克 +引流+NaHS組肝細(xì)胞損傷程度明顯重于休克+引流組，見(jiàn)圖 3I、J。

Figure 3．Changes of hepatic pathomorphology in rats(HE staining;A，C，E，G，I，×100;B，D，F(xiàn)，H，J，×400)．A，B:sham group;C，D:shock group;E，F(xiàn):shock+drainage group;G，H:shock+drainage+PPG group;I，J:shock+drainage+NaHS group．圖3 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化

5 各組大鼠肝組織炎癥因子的變化

如表2所示，休克組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05或P＜0.01)，休克 +引流組大鼠肝組織 TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α較休克組均出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，IL-10、IL-12和 TNF-α含量顯著低于休克組(P＜0.05)，TNF-α含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);休克+引流+PPG組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量進(jìn)一步下降，均顯著低于休克組(P＜0.05或P＜0.01)，TNF-α含量顯著低于休克 +引流(P＜0.05);而加入NaHS的休克+引流+NaHS組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，IL-10、IL-12和 TNF-α含量顯著高于休克+引流組(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 各組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量的變化Table 2．Changes of TLR4，IL-10，IL-12 and TNF-α in hepatic homogenate in rats［ng/(g protein)．Mean ±SD．n=6］

討 論

為了探討H2S在腸淋巴液引流減輕休克大鼠肝損傷中的作用，本研究首先檢測(cè)了各組大鼠肝組織中H2S的含量，發(fā)現(xiàn)休克組大鼠肝組織H2S含量顯著升高，腸淋巴液引流則降低了H2S含量，PPG進(jìn)一步加強(qiáng)了腸淋巴液引流的作用，而腸淋巴液引流的作用被NaHS廢除。這些結(jié)果表明，腸淋巴液引流可降低肝組織H2S含量。一般來(lái)說(shuō)，H2S由CSE以L-半胱氨酸為底物合成，由于CSE存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及多個(gè)器官的組織細(xì)胞，故H2S可產(chǎn)生于機(jī)體的各個(gè)組織，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。因此，肝組織降低的H2S，既有來(lái)自于腸道產(chǎn)生的H2S隨著腸淋巴液引流至體外而減少的原因，又有腸淋巴液引流降低了毒性物質(zhì)引起血液循環(huán)系統(tǒng)以及肝臟本身產(chǎn)生H2S作用的因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，休克組大鼠肝組織CSE含量顯著升高，腸淋巴液引流與PPG降低了休克組大鼠肝組織的CSE含量，而NaHS對(duì)肝組織CSE含量無(wú)顯著影響，這說(shuō)明腸淋巴液引流降低H2S的作用是通過(guò)抑制CSE活性實(shí)現(xiàn)的，而NaHS作為CSE的下游產(chǎn)物，在體內(nèi)可直接生成H2S，故外源NaHS對(duì)CSE活性無(wú)影響。

為了進(jìn)一步探討抑制CSE活性、增加H2S含量是否影響了腸淋巴液引流減輕肝損傷的作用，本文觀察了反映肝功能的生化指標(biāo)以及組織形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)休克組大鼠AST、ALT和TBA顯著升高，而腸淋巴液引流則抑制了這些指標(biāo)的升高，從而減輕了肝損傷的程度;加入PPG使腸淋巴液引流的作用朝著更為有利的方向發(fā)展，相反加入NaHS的大鼠這些指標(biāo)的變化與休克組相似，說(shuō)明NaHS逆轉(zhuǎn)了腸淋巴液引流的作用。同樣的變化在肝組織形態(tài)學(xué)方面得到了證實(shí)。這些結(jié)果提示H2S具有降低腸淋巴液引流減輕失血性休克大鼠肝組織結(jié)構(gòu)損傷的作用，在腸淋巴液引流減輕肝損傷的過(guò)程中發(fā)揮負(fù)面作用。

研究表明，內(nèi)源性氣體分子H2S促進(jìn)了失血性休克動(dòng)物模型全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生，PPG可降低血漿TNF-α、IL-1、IL-6和 IL-10的含量，降低肺組織髓過(guò)氧化物酶活性［11，17］，提示H2S參與了失血性休克后器官損傷的發(fā)生。同樣的研究表明，H2S在嚴(yán)重?zé)齻∈笱装Y反應(yīng)啟動(dòng)的過(guò)程中具有重要意義［18］，TLR4在失控的炎癥反應(yīng)發(fā)生過(guò)程具有重要意義［19-20］，所以，本文從TLR4及其下游炎癥因子的變化，探討H2S在腸淋巴液引流減輕器官損傷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，休克組大鼠肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α含量均顯著升高，腸淋巴液引流則降低了IL-10、IL-12和TNF-α的含量，表明腸淋巴液引流減輕了肝組織的炎癥反應(yīng);休克+引流組大鼠給予PPG后，進(jìn)一步降低了肝組織TLR4、IL-10、IL-12和TNF-α的含量;H2S供體NaHS在增加休克+引流組大鼠肝組織TLR4含量的同時(shí)，增加了肝組織IL-10、IL-12和TNF-α含量，提示外源性H2S加劇了這些組織器官的炎癥反應(yīng)，成為組織器官損傷的重要發(fā)病機(jī)制。值得注意的是，在創(chuàng)傷、失血等因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的增高以及隨后的抗炎反應(yīng)增強(qiáng)，以至于表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)在高水平上的交替，這也成為失控的炎癥反應(yīng)、器官損傷的重要因素。在本研究中，失血性休克后抗炎細(xì)胞因子IL-10與炎癥介質(zhì)IL-12、TNF-α均出現(xiàn)了增高，提示此時(shí)機(jī)體處于炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)互相競(jìng)爭(zhēng)的階段;而腸淋巴液引流均降低了肝組織炎癥介質(zhì)與抗炎因子的水平，這對(duì)于降低機(jī)體炎癥反應(yīng)是有利的;而PPG與NaHS對(duì)腸淋巴液引流后的作用也顯示，作為前炎癥氣體信號(hào)分子的H2S在腸淋巴液引流降低肝組織炎癥反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮負(fù)面作用。

應(yīng)當(dāng)指出，盡管休克腸淋巴液引流使肝組織TLR4含量有下降的趨勢(shì)，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與觀察時(shí)間等因素有關(guān);但給予CSE抑制劑PPG降低了肝組織的炎癥反應(yīng)，給予NaHS在增加TLR4的同時(shí)，亦導(dǎo)致了肝組織的炎癥反應(yīng)，結(jié)果說(shuō)明H2S加重肝損傷的作用機(jī)制與炎癥反應(yīng)加劇有關(guān)。當(dāng)然，這有待在以后的研究中進(jìn)一步深入探討。同時(shí)，由于Mok等［11］的研究已經(jīng)證明了PPG可降低失血性休克大鼠血清的炎癥介質(zhì)水平，減輕肝的組織損傷，故本研究沒(méi)有設(shè)置PPG對(duì)休克大鼠作用的休克+PPG組。

總之，休克腸淋巴液引流可減輕失血性休克大鼠肝臟的組織學(xué)損傷與功能障礙，其作用機(jī)制與降低H2S含量有關(guān)。以腸淋巴液和氣體信號(hào)分子H2S作為干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)于防治失血性休克后的肝損傷具有重要意義。