二氧化硫?qū)Υ笫笾w缺血再灌注所致肺損傷的影響及其作用機制*

黃新莉， 周君琳， 黎 寧， 范伯元

(1河北醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，河北石家莊050017;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院骨科，北京100020;3石家莊市第三醫(yī)院骨科，河北石家莊050011)

肢體缺血是臨床常見的病理征象，盡管恢復(fù)其血液循環(huán)是挽救肢體所必須的，但是缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)不僅可能加重局部缺血組織的損傷，嚴重時尚可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至遠隔的多臟器功能障礙綜合征，其中肺是易受累的首位靶器官，表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury，ALI)甚至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］，病死率極高。盡管關(guān)于肢體IR后ALI的發(fā)病機制迄今尚未完全闡明，但現(xiàn)在較為公認的看法是肢體IR使機體的炎癥反應(yīng)細胞處于激活狀態(tài)，繼而出現(xiàn)了失控的全身炎癥反應(yīng)。此時多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在肺部大量聚集是肺損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［2］。肺是氣體交換的場所，氣體分子對肺的影響尤為重要，“氣體信號分子家系”的發(fā)現(xiàn)將肺損傷等疾病的研究帶入了一個全新的階段［3］。自上世紀80年代以來，已陸續(xù)證實代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性氣體分子一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)可以作為信號分子參與機體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，并且具有重要的生理和病理生理意義，由此開創(chuàng)了“氣體信號分子家系”的新領(lǐng)域。新近，另外一個小分子氣體物質(zhì)二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)的生物學(xué)效應(yīng)開始引起人們的關(guān)注。SO2是全球性的常見大氣污染物，其暴露的主要毒害是對人和嚙齒類動物的呼吸道產(chǎn)生刺激和腐蝕作用，并與一些呼吸系統(tǒng)疾病(例如氣管炎、哮喘、肺氣腫等)的發(fā)生有關(guān)［4］，但SO2也可由健康人體含硫氨基酸的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。最新研究顯示［5］，內(nèi)源性SO2具有改變心率、降低血壓、擴張血管等效應(yīng)，可能是一種新的信使分子關(guān)于內(nèi)源性SO2對肺損傷作用的研究較少。Jin等［6］研究顯示，SO2可以使野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺及血漿中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶水平明顯增高，具有一定的抑制氧化損傷作用。本課題組研究證實外源性SO2可抑制脂多糖所致大鼠肺損傷時肺組織中的炎癥反應(yīng)從而減輕肺損傷的程度［7］。本實驗旨在觀察大鼠肢體IR致ALI時SO2及其生成關(guān)鍵酶天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)的變化以及SO2供體亞硫酸鈉/亞硫酸氫鈉(Na2SO3/NaHSO3)和AST抑制劑異羥肟酸(hydroxamate，HDX)對此種肺損傷的影響，以探討內(nèi)源性和外源SO2對大鼠肢體 IR所致 ALI的作用及可能機制。

材料和方法

1 材料

Na2SO3/NaHSO3、HDX及其它化學(xué)試劑均購自Sigma。臨用前Na2SO3/NaHSO3用無菌注射用水以3∶1(0．54 mmol/kg∶0．18 mmol/kg)新鮮配制混合液，作為外源性 SO2供體。HDX按 0．47 mmol/kg以無菌注射用水新鮮配制，無菌注射用水和生理鹽水購自本院藥房。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、AST、細胞因子試劑盒和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)單克隆抗體均購自北京中杉公司。體重為250～300 g的健康SD雄性大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動物試驗中心)。其它試劑均為分析純。

2 方法

2．1 動物模型 按照 Cohen等［8］提供的方法復(fù)制肢體IR致ALI動物模型。體重為250～300 g的健康SD雄性大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動物試驗中心)用苯巴比妥鈉(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉。分離左側(cè)頸外靜脈及右側(cè)頸總動脈插管以補液(乳酸林格氏液2 mL/h)、給藥及采血。以橡皮止血帶綁扎雙后肢根部造成肢體缺血，4 h后松開止血帶使肢體血流再灌注。應(yīng)用激光多普勒(Pri Flux 5001型，Perimed)探測血流以保證肢體的缺血和再灌注。

2．2 實驗分組 將96只SD大鼠隨機分為6組:假手術(shù)(sham)組、sham+SO2組、sham+HDX組、IR組、IR+SO2組和IR+HDX組。對照組動物給予同樣的麻醉和操作，只是不造成肢體缺血。IR組動物雙后肢缺血4 h再灌注4 h。于再灌注前10 min和相應(yīng)的對照時點靜脈給予藥物處理:IR+SO2和sham+SO2組分別給予Na2SO3/NaHSO30．5 mL;HDX+IR和HDX+sham組動物分別給予 HDX 0．5 mL;sham組和IR組動物分別給予等量溶劑對照(無菌生理鹽水0．5 mL)。實驗結(jié)束時，各組8只動物用于24 h存活情況觀察，另8只動物進行下述指標檢測。

2．3 檢測指標和方法

2．3．1 肺系數(shù)測定 自氣管分叉以上第5、6軟骨環(huán)間剪斷氣管，將肺臟組織完整取出，用濾紙吸干其表面血污后稱質(zhì)量。肺系數(shù)=全肺濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)。

2．3．2 肺組織學(xué)檢查及其PMN計數(shù) 取右肺下葉，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，并隨機計數(shù)10個高倍鏡視野(HP)中肺泡間隔PMN平均數(shù)目，用以衡量PMN在肺組織中的聚集情況。

2．3．3 肺組織勻漿上清液的制備及蛋白定量 取右肺組織中葉，用預(yù)冷的生理鹽水洗去殘血，濾紙吸干，分析天平稱重后。4℃，用電動勻漿器制成10%(W/V)的勻漿。4℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上清，進行分裝，采用改良酚試劑法測定蛋白含量，其余 －80℃避光儲存。

2．3．4 肺組織勻漿中MDA含量的檢測 MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化所形成的產(chǎn)物，故其含量變化可反應(yīng)組織氧化損傷的程度。應(yīng)用MDA檢測試劑盒按照其操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法檢測肺組織勻漿上清中MDA含量，結(jié)果以μmol/L表示。

2．3．5 肺組織SO2水平測定 高效液相色譜(highperformance liquid chromatography，HPLC)熒光法檢測組織SO2水平。100μL肺組織勻漿上清加入70 μL 硼氫化鈉(0．212 mol/L，溶于0．05 mol/L、pH 8．5的Tris液)室溫孵育30 min。加入10μL單溴二胺(70 mmol/L，溶于乙腈)，充分混勻，42℃孵育10 min。加入 40μL高氯酸(1．5 mol/L)混勻，12 400 r/min，離10 min，取上清液，加入 10μL Tris液(2.0 mol/L，pH 3．0)輕輕混勻，12 400 r/min離心8 min，留取上清液進行HPLC(1100型高效液相色譜儀，惠普 Agilent公司)分析。流動相 A:甲醇、乙酸及水的體積比為 5．00∶0．25∶94．75，pH 3．4;流動相B:甲醇(甲醇梯度:0～8 min，50 mL/L;8～15 min，50～120 mL/L;15～20 min，120 mL/L;20～30 min，120～200 mL/L;30～32 min，200 mL/L;32～35 min，200 ～1 000 mL/L;35 ～40 min，1 000 mL/L;40～43 min，1 000～30 mL/L;43～45 min，30 mL/L)。激發(fā)波長392 nm，檢測波長479 nm。結(jié)果以μmol/g蛋白表示。

2．3．6 肺組織AST水平檢測 采用自動生化儀(Hitachi 7600，Tokyo)檢測肺組織勻漿上清中AST活性，結(jié)果以103U/g蛋白表示。

2．3．7 血清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白細胞介素(interleukin，IL)-1水平的測定 使用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α和IL-1濃度，按說明書進行操作。

2．3．8 肺組織ICAM-1蛋白表達的檢測 采用免疫熒光流式細胞術(shù)檢測肺組織中ICAM-1的表達:將于70% 乙醇中固定的標本用生理鹽水沖洗后，用搓網(wǎng)法制備單細胞樣品。取1×109/L肺組織細胞，用PBS洗滌2次，每次2 min，1 000 r/min離心去上清液，加入1∶50兔抗大鼠ICAM-1單克隆抗體，在37℃水浴中溫育30 min，用PBS離心洗滌2次，棄上清，加入1∶100稀釋的熒光染料FITC標記的羊抗兔IgG 100μL，37℃溫育30min，離心洗滌2次，棄上清，除去未結(jié)合的多余熒光抗體，上機檢測前加入1.0 mL PBS，經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾。同時設(shè)有:(1)PBS代替Ⅰ抗的陰性對照;(2)只加Ⅰ抗的陽性對照;(3)只加1∶100 FITC標記的IgG(Ⅱ抗)的陽性對照。以熒光指數(shù)(FI)表示ICAM-1蛋白的相對含量，F(xiàn)I=(樣品蛋白表達的平均熒光強度－對照組平均熒光強度)/對照組平均熒光強度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件分析。PMN數(shù)量和動物存活率行多樣本均數(shù)比較的秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)和兩兩比較的秩和檢驗(Nemenyi法)，其它結(jié)果行單因素方差分析，有顯著差異者再行q檢驗(Newman-Keul法)進行兩兩比較。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織形態(tài)學(xué)和PMN聚集的變化

光鏡下觀察可見，肢體缺血4 h再灌注4 h，肺組織出現(xiàn)水腫、出血及PMN浸潤的組織學(xué)變化。應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3后則明顯減輕，而應(yīng)用HDX處理后上述肺組織學(xué)改變進一步加重。與sham組相比，IR組肺泡間隔中 PMN數(shù)目顯著增高(P＜0.05);與IR組相比，IR+HDX組肺組織PMN數(shù)目進一步增加(P＜0．05)，而IR+SO2組則明顯減少(P ＜0．05);sham、sham+HDX 和 sham+SO2組之間無顯著差異(P ＞0．05)，見圖1、表1。

2 肺系數(shù)和肺組織中MDA含量的變化

各組大鼠二者的變化趨勢一致。與sham組相比，IR組明顯增高(P＜0．05)，與IR組相比，I/R+HDX組進一步增高(P＜0．05)，而IR+SO2組則明顯減少(P＜0．05);sham、sham+HDX和 sham+SO2組之間無顯著差異(P＞0．05)，見表1。

Figure 1．Effects of SO2 on rat lung tissue structure following IR of hind limbs(HE staining，×400)．A:sham group;B:sham+SO2 group;C:sham+HDX group;D:IR group;E:IR+HDX group;F:IR+SO2 group．圖1 SO2對大鼠肢體IR致肺損傷時肺組織結(jié)構(gòu)的影響

表1 SO2對大鼠肢體IR致肺損傷時肺組織PMN數(shù)目、LW/BW和MDA含量的影響Table 1．Effects of SO2 on lung PMN number，LW/BW and MDA content following IR of hind limbs in rats(Mean±SD．n=8)

3 動物24 h存活率

Sham組動物全部存活，存活率為100%;而IR后大鼠死亡4只，動物24 h存活率(50%)顯著降低(P＜0．05);與I/R組相比，動物24 h存活率IR+HDX 組(37．5%)降低，而 IR+SO2組(62．5%)則明顯提高(均P＜0．05);sham、sham+HDX和 sham+SO2組動物均全部存活。

4 肺組織SO2含量和AST活性的變化

與sham組相比，sham+SO2組SO2含量顯著增高(P＜0．05)，AST活性無顯著變化(P ＞0．05)，sham+HDX組SO2含量和AST活性均顯著降低(P＜0.05)。與sham組相比，IR組SO2含量和AST活性均顯著降低(P＜0.05);與IR組相比，I/R+HDX組二者進一步降低(P＜0.05)，而IR+SO2組SO2水平顯著提高(P＜0．05)，AST活性無顯著變化(P ＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織中SO 2含量和AST活性的變化Table 2．Changes of SO2 concent and AST activity in lung of rats(Mean±SD．n=8)

5 血清細胞因子和肺組織中ICAM-1表達的變化

與sham組相比，IR組IL-1、IL-6和 IL-10水平升高，肺組織中ICAM-1蛋白表達量顯著增加(P＜0．01)。與IR組相比，I/R+HDX組IL-1和IL-6進一步增高(P＜0.05)、IL-10水平無顯著變化(P＞0.05)，IR+SO2組IL-1和IL-6顯著降低、IL-10水平則顯著增高(P＜0.05);sham組和sham+HDX組之間相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，見表3。

表3 SO2對肢體IR所致肺損傷鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達和血清中IL-1、TNF-α含量的影響Table 3．Effects of SO2 on ICAM-1 expression in the lung tissues，and IL-1 and TNF-α levels in the serum of rats with IR-induced lung injury(Mean±SD．n=8)

討 論

SO2是全球性的常見大氣污染物，大劑量、長時間暴露會對環(huán)境和人體造成較大危害。已證實，高濃度的SO2及其衍生物，不僅可損害支氣管和肺，還可損害胃腸道、肝、腎、心臟及神經(jīng)系統(tǒng)，對機體各個臟器均可造成損傷［9］。一些學(xué)者提出了大氣中SO2的健康危害閾值:成年人為0．8 mg/m3，兒童為0．6 mg/m3，超過該閾值，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率會顯著增加［10］。但是，SO2也可由健康人體含硫氨基酸的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。L-半胱氨酸在半胱氨酸氧化酶的作用下氧化為L-半胱氨酰亞磺酸，后者在GOT的作用下轉(zhuǎn)氨基生成 β-亞磺酰丙酮酸，后者自發(fā)分解為丙酮酸和SO2。在體內(nèi)，SO2與水結(jié)合產(chǎn)生其衍生物亞硫酸氫鹽和亞硫酸鹽(HSO3－/SO32－)，二者量(摩爾)比為 1∶3。SO32－再經(jīng)亞硫酸氧化酶的氧化作用生成SO42－排出體外，其中仍有一小部分SO2以游離形式存在。正常人血清亞硫酸鹽濃度在 0～9.85 μmol/L 之間［11］;大鼠血漿 SO2濃度為(16.77 ±8.24)μmol/L，胸主動脈血管組織 SO2濃度為(127.76 ±31.34)μmol/L［12］。那么，機體產(chǎn)生和存在的SO2有何作用呢?隨著對新型小分子氣體信使如NO、CO、H2S等作用的不斷發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們開始對SO2的生理作用產(chǎn)生興趣。近來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性SO2是一種血管舒張因子，在生理相關(guān)濃度或低濃度下(1～2 mmol/L)具有顯著的、劑量依賴性的血管舒張作用［13］，具有降低肺動脈高壓和高血壓等作用。表明，SO2可能是繼NO、CO、H2S之后新發(fā)現(xiàn)的又一重要信使分子。

本研究在大鼠肢體 IR所致ALI模型上發(fā)現(xiàn)大鼠肢體IR致肺損傷時，肺內(nèi)SO2含量和GOT活性下降。為進一步闡明SO2/GOT通路變化的意義，本研究分別觀察了補充SO2以及進一步抑制SO2對此種肺損傷的作用。通過預(yù)實驗我們發(fā)現(xiàn)SO2供體Na2SO3/NaHSO3(mmol/kg∶mmol/kg)劑量分別為0.135∶0．045、0．27∶0．09、0．54∶0．18 和 0．61∶0．27時可呈劑量依賴性減輕大鼠肢體IR所致肺損傷時肺系數(shù)的增高(待發(fā)表)。結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果及相關(guān)文獻報道［6］，本研究采用 0．54 mmol/kg∶0．18 mmol/kg 的Na2SO3/NaHSO3為 SO2供體。結(jié)果顯示，Na2SO3/NaHSO3可明顯逆轉(zhuǎn)大鼠肢體IR所致肺損傷時SO2含量的降低，同時明顯減輕肢體IR所致肺損傷程度、提高動物的存活率;而應(yīng)用AST活性抑制劑HDX抑制AST活性從而使SO2產(chǎn)生減少則明顯加重此種肺損傷、降低動物的存活率，結(jié)果提示肢體IR后肺內(nèi)SO2/AST體系的下調(diào)參與介導(dǎo)了肢體IR后ALI的發(fā)生，內(nèi)源性和外源性 SO2具有抑制肢體 IR所致肺組織損傷的保護作用。0．54 mmol/kg∶0.18 mmol/kg Na2SO3/NaHSO3雖然可明顯提高肺組織SO2水平，但從實驗結(jié)果來看其仍在生理水平范圍，理論上不會對正常組織造成損傷，實驗結(jié)果也證實如此，即未發(fā)現(xiàn) 0．54 mmol/kg∶0．18 mmol/kg Na2SO3/NaHSO3對假手術(shù)對照組動物產(chǎn)生明顯損害。張素清等［14］研究顯示SO2可加重大鼠離體心肌的IR損傷，但作者并未檢測組織中SO2的實際水平和變化，而且同一課題組隨后的進一步研究報告顯示，SO2可提高心肌組織內(nèi)抗氧化酶活性、緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷［15］，與本研究結(jié)果基本一致。

肢體IR引起肺損傷的實質(zhì)是肺組織中發(fā)生了失控的炎癥反應(yīng)，大量致炎因子和活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生以及PMN在肺部大量聚集是肺損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［2］。因此，抗炎、抗氧化、抑制PMN聚集是防治此種損傷的重要策略。本研究通過對肢體IR致ALI時肺組織病理學(xué)變化、PMN數(shù)目、氧化損傷產(chǎn)物MDA含量和肺系數(shù)以及炎癥因子變化的檢測進一步佐證了此種病理生理變化，同時發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性SO2產(chǎn)生可使肺內(nèi)MDA含量、PMN數(shù)目和炎癥細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α水平進一步增高、肺損傷進一步加重，而補充SO2可明顯降低上述指標變化、減輕肺損傷程度，提示SO2具有抗炎、抗氧化、抑制PMN聚集的作用。

PMN在肺內(nèi)的聚集是由位于PMN和肺微血管內(nèi)皮細胞表面的一系列黏附分子(如L-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、血管細胞黏附分子1和CD44等)表達上調(diào)所介導(dǎo)的;抑制肢體IR所致的黏附分子表達上調(diào)是抑制PMN聚集的重要策略。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肢體IR可明顯上調(diào)肢體IR后肺內(nèi)ICAM-1表達，應(yīng)用AST活性抑制劑HDX使SO2產(chǎn)生減少后肺內(nèi)ICAM-1表達進一步增高，應(yīng)用SO2供體Na2SO3/NaHSO3可使ICAM-1表達顯著降低，提示SO2抑制肢體IR所致ALI及PMN聚集的機制與其抑制黏附分子表達有關(guān)。