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    沉默bim的表達對缺氧所致大鼠心肌細胞凋亡的影響*

    2013-12-01 02:29:06李菊香孫國芳吳延慶程曉曙
    中國病理生理雜志 2013年10期
    關(guān)鍵詞:節(jié)律存活率心肌細胞

    夏 珍, 李菊香, 丁 浩, 孫國芳, 洪 葵, 吳延慶, 程曉曙

    (南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科,江西省分子中心醫(yī)學重點實驗室,江西南昌330006)

    冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease),由于冠狀動脈管腔粥樣硬化而狹窄或阻塞,導致心肌缺血和缺氧而引起的心臟病,具有較高的致病率和致死率。心絞痛、心肌梗死和缺血性心臟病等共同的病理基礎(chǔ)都是心肌缺血缺氧,導致細胞凋亡[1]。因此,如何保護缺血損傷的心肌細胞是醫(yī)學上急待解決的問題。

    Bim是Bcl-2家族中僅含BH3結(jié)構(gòu)功能域的重要促凋亡蛋白。DNA損傷、血清饑餓、紫杉醇等刺激均可影響B(tài)im的表達來引起細胞的凋亡[2-4]。Bim作為細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,對于缺氧損傷誘導的心肌細胞凋亡發(fā)揮了怎樣的生物學作用,是否介導了缺氧刺激誘導心肌細胞凋亡,目前在國內(nèi)外未見報道。在本研究中,我們首先原代培養(yǎng)心肌細胞,通過小干擾RNA技術(shù)沉默bim的表達,然后建立缺血缺氧損傷模型,觀察Bim在缺氧誘導心肌細胞凋亡中的作用,為今后將Bim作為阻斷缺氧誘導心肌細胞凋亡的靶點奠定基礎(chǔ)。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動物 出生1~3 d Sprague-Dawley大鼠,由南昌大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供,動物合格證為醫(yī)動字021-9602。

    1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。抗α-橫紋肌肌動蛋白免疫組化試劑盒和FITC羊抗兔IgG購自武漢博士德。MTT細胞存活率檢測試劑盒購自Ameresco。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司??偟鞍滋崛≡噭┖匈徸云绽R基因技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen。bim-siRNA購自Invitrogen。I抗 Bim、p-p38 MAPK、p38 MAPK、Bax、Bcl-2及β-actin購自Santa Cruz。II抗辣根過氧化物酶IgG購自北京中杉金橋公司。

    2 方法

    2.1 原代心肌細胞培養(yǎng)及鑒定 取出生1~3 d乳鼠心臟,用含雙抗(青霉素+鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液清洗3次,剝除筋膜、脂肪等多余組織,用剪刀將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織,用0.08%胰酶和1.00%Ⅱ型膠原酶消化組織,離心收集細胞以15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分重懸,200目濾網(wǎng)過濾細胞懸液至培養(yǎng)皿,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),經(jīng)差速貼壁2 h,使成纖維細胞貼壁。然后小心吸出未貼壁心肌細胞懸液接種到放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中,加入0.1%BrdU抑制成纖維細胞的增殖。24 h后第1次換液,48 h后取出玻片,用37℃ PBS漂洗,4%甲醛固定,加大鼠抗α-橫紋肌肌動蛋白單克隆Ⅰ抗1∶50,于4℃濕盒過夜,加FITC羊抗小鼠IgG 1∶50,孵育30 min,緩沖鹽水洗2次,DAPI封片劑染核,顯微鏡下觀察。

    2.2 缺氧模型的建立和轉(zhuǎn)染 配置模擬缺氧溶液,以95%N2~5%CO2預飽和1 h,置換正常培養(yǎng)基,放入缺氧盒中通95%N2~5%CO230 min后密閉缺氧盒,放置于37℃孵箱中缺氧。我們通過前期實驗,發(fā)現(xiàn)Bim在心肌細胞缺氧12 h表達最高。將bim-siRNA和陰性對照siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞。按操作說明用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋適當量的Lipofectamine 2000和bim-siRNA混合形成轉(zhuǎn)染試劑混合液,加入心肌細胞密度為90% 的6孔板中,輕輕搖晃混合。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后,將心肌細胞置于缺氧盒中缺氧12 h。實驗分為5組:(1)正常對照組;(2)缺氧組;(3)缺氧+陰性對照siRNA組;(4)缺氧+脂質(zhì)體組;(5)缺氧+bim-siRNA組。Invitrogen公司設(shè)計、合成了3對bim-siRNA序列,將3對bim-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞,篩選沉默效率最高的Bim-siRNA用于后續(xù)實驗。siRNA-1上游引物5’-AACAGAUGUAAGUUAACGAUUUCCG-3’,下游引物5’-UGGUCAAUACUACAUGUGAUACCUU-3’;siRNA-2上游引物 5’-AACAGUUGUAAGAUAACCAUUU-GCG-3’,下游引物 5’-CGCAAAUGGUUAUCUUACAACUGUU-3’;siRNA-3 上游引物 5’-ACAGAUUGUAGAUACAACAUUUGCG-3’,下游引物 5’-CAUGGUUCGUAAUACAACUGACUUU-3’;陰性對照:上游引物 5’-GUCCUCGACCUAGUUACGUTT-3’,下游引物5’-UCUAGACACAGUCGGAGAGTT-3’。

    2.3 心肌細胞搏動率和節(jié)律 在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察60 s,分別計數(shù)10個高倍視野有自發(fā)搏動的細胞個數(shù),進行攝像記錄心肌細胞自發(fā)搏動頻率。細胞搏動率(%)=搏動細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。同時觀察心肌細胞搏動節(jié)律的變化情況。

    2.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的測定 將各組經(jīng)不同處理后的細胞培養(yǎng)液收集起來,取適量利用全自動生化分析儀測定LDH的活性。

    2.5 MTT法測定細胞存活率 取96孔板種植細胞,密度為1×105cells/well,空白孔加不含細胞的培養(yǎng)液(每組4孔)。經(jīng)實驗干預后,每孔加入20μL MTT溶液(5 g/L),避光,繼續(xù)溫育4 h,小心吸棄上清,終止培養(yǎng),然后加入150μL DMSO,搖床振搖15 min,使結(jié)晶充分溶解,酶標儀讀取492 nm處吸光度(absorbance,A)。結(jié)果以細胞存活率表示。細胞存活率(%)=處理組A值/對照組A值×100%。

    2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h、缺氧12 h后用胰酶消化收集各組細胞。按Annexin VFITC試劑盒提供的操作說明,主要步驟為:用胰酶消化收集細胞,PBS洗滌細胞2次,加入500μL Binding Buffer重懸細胞,分別加入 Annexin V-FITC及PI各5μL混勻,室溫避光反應5~15 min后,在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

    2.7 Western blotting檢測各蛋白表達水平 取各組心肌細胞,根據(jù)總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,用全自動生化分析儀(Beckman)測定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白濃度取適量進行SDS-PAGE電泳分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后,將膜置于5%脫脂奶粉的TBST中搖床上封閉2 h,用TBST洗膜10 min,共 3 次,分別用 Bim、Bax、Bcl-2、p-p38 MAPK、p38 MAPK和β-actin的I抗按適當比例4℃孵育過夜,再洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔IgG孵育2 h,最后洗膜3×10 min,進行顯色,膠片曝光,結(jié)果用LabWorks 3.0軟件,以目的條帶/β-actin的灰度值進行分析。

    3 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差(mean±SD)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行軟件分析,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 原代心肌細胞的成功培養(yǎng)及鑒定

    于倒置顯微鏡下觀察,細胞呈放射狀、不規(guī)則三角形或梭形,并伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng),呈片狀有節(jié)律搏動。免疫組化結(jié)果顯示,抗體陽性的心肌細胞胞漿內(nèi)可見棕色顆粒,見圖1。

    Figure 1.Identification of the cardiomyocytes(×200).A:inverted microscopy;B:immunohistochemical staining forα-actin of striated muscle.圖1 心肌細胞的鑒定

    2 篩選有效bim-siRNA

    與陰性對照siRNA組比較,3對bim-siRNA均能顯著降低Bim蛋白的表達,其中以第2對沉默效率最高(P <0.01),其沉默效率達86.73%,見圖 2。

    Figure 2.The effects of siRNAs on expression of Bim.A:hypoxia group;B:hypoxia+liposome group;C:hypoxia+negative control siRNA group;D:hypoxia+siRNA-1 group;E:hypoxia+siRNA-2 group;F:hypoxia+siRNA-3 group.Mean ± SD.n=6.##P <0.01 vs hypoxia+negative control siRNA group.圖2 bim-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞對Bim表達的影響

    3 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細胞搏動頻率和節(jié)律的影響

    空白對照組心肌細胞搏動頻率為150 beats/min左右,搏動呈同步性,收縮明顯而有力,節(jié)律規(guī)則;缺氧刺激后心肌細胞搏動頻率顯著減慢(P<0.01),搏動幅度減小,節(jié)律不規(guī)則;而轉(zhuǎn)染bim-siRNA能抑制缺氧導致的這一作用(P<0.05或 P<0.01),見表1。

    4 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細胞LDH釋放、細胞存活率及凋亡率的影響

    與空白對照組比較,缺氧組心肌細胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯增高(P<0.01),細胞存活率明顯降低(P <0.05),細胞凋亡率明顯增高(P <0.01);而進行bim-siRNA轉(zhuǎn)染后,心肌細胞培養(yǎng)液中LDH較缺氧+陰性對照siRNA組明顯下降(P<0.01),細胞存活率明顯增加(P<0.05),細胞凋亡率明顯下降(P<0.01),而陰性對照siRNA組則與缺氧組無明顯差異,見表2、圖3。這說明通過 RNA干擾下調(diào)Bim表達能抑制缺氧導致心肌細胞的凋亡。

    表1 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細胞搏動頻率和節(jié)律的影響Table 1.The changes of frequency and rhythm of cardiomyocyte beating after bim-siRNA transfection and hypoxia(beats/min.Mean ±SD.n=8)

    表2 轉(zhuǎn)染bim-RNA和缺氧對心肌細胞LDH釋放、細胞存活率及細胞凋亡率的影響Table 2.The changes of LDH release,survival rate and apoptotic rate of cardiomyocytes treated with Bim-siRNA transfection and hypoxia(Mean±SD.n=8)

    Figure 3.The changes of apoptotic rate of cardiomyocytes treated with bim-siRNA transfection and hypoxia.A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+bim-siRNA group.圖3 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細胞凋亡率的影響

    5 Western blotting檢測心肌細胞 Bax、Bcl-2、pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達水平

    Western blotting結(jié)果顯示,與空白對照組比較,缺氧干預后,心肌細胞內(nèi)p-p38 MAPK和Bax的表達明顯增加(P <0.05),Bcl-2表達下降(P <0.01);而通過bim-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)Bim表達后,能抑制缺氧導致的這一作用(P<0.05),而p38 MAPK表達無明顯變化。缺氧組與缺氧+陰性對照siRNA組、缺氧+脂質(zhì)體組之間相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖4。

    討 論

    Bim是Bcl-2家族中僅含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白,是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白。它廣泛分布于機體各種組織,與調(diào)節(jié)細胞凋亡的功能密切相關(guān),具有促凋亡活性。在正常細胞中,Bim與細胞漿中的微管蛋白相結(jié)合,形成復合體,此時的Bim是無活性的,當受到凋亡信號刺激后,Bim就會從復合體上解離出來游離在細胞漿中,激活 caspase酶聯(lián)反應,最終導致細胞凋亡。有研究表明,Bim在三氧化二砷誘導卵巢癌細胞的凋亡的過程中發(fā)揮重要作用,它是調(diào)控三氧化二砷誘導卵巢癌細胞化療敏感和耐藥的主要機制[5]。Bim可直接促進糖皮質(zhì)激素誘導淋巴細胞惡性腫瘤的凋亡[6]。而關(guān)于Bim在缺血缺氧刺激下對心肌細胞凋亡的作用報道甚少,沉默bim的表達對缺氧致心肌細胞凋亡的影響目前尚未見報道。因此,本實驗利用原代培養(yǎng)的心肌細胞制備缺氧損傷模型,模擬臨床上心肌缺血缺氧損傷誘導細胞凋亡,用小干擾RNA沉默bim的表達,觀察心肌細胞凋亡的變化情況。結(jié)果顯示,缺氧損傷可誘導心肌細胞的凋亡,降低其存活率,增加p-p38 MAPK和Bax的表達,降低Bcl-2的表達;而下調(diào)Bim的表達能抑制缺氧損傷導致的上述作用。

    越來越多的研究表明,心血管疾病的發(fā)生發(fā)展是基于細胞凋亡的基礎(chǔ)之上的[7-8]。多種刺激均可誘導心肌細胞凋亡,如缺氧、缺血再灌注、氧化應激及腫瘤壞死因子α[9-11]。在本實驗研究中我們可以得出,心肌細胞缺氧損傷后,細胞的存活率下降、LDH釋放量增加、凋亡率明顯升高,而下調(diào)Bim的表達能夠降低缺氧對心肌細胞的損傷作用、提高心肌細胞的存活率,減少LDH的釋放。說明下調(diào)Bim的表達對缺血缺氧造成的心肌細胞損傷具有保護作用,這也為心肌缺血缺氧性疾病的治療提供一種可能途徑。

    Figure 4.The changes of Bax,Bcl-2,p-p38 MAPK and p38 MAPK protein levels in cardiomyocytes treated with bim-siRNA transfection and hypoxia.A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+bim-siRNA group.Mean ± SD.n=8.*P <0.05,**P <0.01 vs blank control group;#P < 0.05 vs hypoxia+negative control siRNA group.圖4 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧處理后心肌細胞Bax、Bcl-2、pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達水平的變化

    絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族在細胞生物學活動中發(fā)揮重要作用,可調(diào)節(jié)多種細胞的基因轉(zhuǎn)錄、增殖、分化和凋亡[12]。p38是MAPK家族中一個重要的細胞內(nèi)信號通路,有研究報道,氧化應激、缺血再灌注損傷等通過下調(diào)p38表達,進而減少或抑制心肌細胞的凋亡[13-14]。研究表明,絲裂原活化蛋白激酶在心臟疾病的誘導和應激刺激下,參與肥大、重塑、收縮和心臟衰竭等過程,通過抑制 p38 MAPK信號通路,Dusp1/4基因才能發(fā)揮心臟保護作用[15]。Bim誘導缺血缺氧的心肌細胞凋亡,涉及復雜的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑,至今尚未闡明。文獻報道,Bim誘導心肌細胞凋亡受PI3K/Akt、JNK等多種途徑的影響[16-17]。也有文獻報道,p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑參與了Bim誘導細胞凋亡的過程[18]。在本實驗中我們觀察缺氧后以及沉默bim表達后心肌細胞內(nèi)p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的表達水平。結(jié)果顯示:缺氧損傷使磷酸化的p38 MAPK水平升高,細胞凋亡率增加,說明缺氧損傷激活了p38 MAPK信號通路。Bim表達下調(diào)能夠抑制缺氧導致磷酸化的p38 MAPK蛋白表達升高的作用,進一步證明下調(diào)bim的表達可抑制缺氧導致的心肌細胞凋亡的作用,同時也說明Bim可能通過p38 MAPK途徑介導缺氧致心肌細胞損傷。bax是促凋亡基因,bcl-2是抑制凋亡基因。Bax蛋白表達下降、Bcl-2蛋白表達升高表明細胞凋亡被抑制。本實驗結(jié)果顯示,心肌細胞予缺氧處理后,促凋亡蛋白Bim水平升高,Bax表達上調(diào),Bcl-2表達下降,而沉默bim的表達可抑制缺氧導致的上述作用,再次證明下調(diào)Bim的表達能抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡的作用。

    綜上所述,下調(diào)Bim的表達能抑制缺氧所致的心肌細胞存活率下降、凋亡率增加,進而發(fā)揮心肌保護作用,其機制可能與抑制p38 MAPK、Bax水平及增強Bcl-2表達有關(guān)。這為冠心病的臨床治療提供一個新思路。

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