類人慢性粒細(xì)胞性白血病小鼠模型的建立*

潘 勤， 金 紅， 李 婧， 姜支農(nóng)， 姚云斌， 胡金飛， 李 達(dá)， 金 梅， 潘宏銘

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州310016)

慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。其特征性的染色體易位t(9;22)(q34;q11)使位于9q34的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因的3'端，形成BCR/ABL融合基因，由此產(chǎn)生的衍生第22號(hào)染色體又稱為費(fèi)城染色體(Philadelphia chromosome，Ph)。95% 的CML患者骨髓中可檢測(cè)到費(fèi)城染色體和(或)BCR/ABL融合基因［1］。以往對(duì)于CML的研究結(jié)果，多來自患者外周血、骨髓細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞系水平的研究。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)CML的認(rèn)識(shí)取得了很大進(jìn)展。近來動(dòng)物模型在腫瘤病因的揭示、發(fā)病機(jī)制的探索以及治療措施的評(píng)估中顯示出了不可替代的重要作用［1］。在本研究中，我們通過改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝技術(shù)，用p210 BCR/ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染小鼠骨髓細(xì)胞成功建立了CML小鼠移植模型，為進(jìn)一步研究CML的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展，篩選新的治療藥物，研究其它致癌基因的功能提供了平臺(tái)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 6～8周齡雌性和雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MigR1(MSCVIRES-GFP，逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體)由Warren S.Pear博士惠贈(zèng);將Nco I-Mlu I-Not I-Nco I接頭序列插入MigR1的Nco I位點(diǎn)，然后將BCR/ABL cDNA克隆入Mlu I和Not I位點(diǎn)之間，構(gòu)建BCR/ABL載體(MSCVBCR-ABL-IRES-GFP，含BCR/ABL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)。MigR1及BCR/ABL載體的簡圖見圖1。

1.3 細(xì)胞 BOSC23包裝細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞均用DMEM(Gibco-BRL)培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中包括:10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試劑 BCR抗體，β-actin抗體，抗兔IgG-HRP均購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體磷酸鈣法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞及技術(shù)改進(jìn) 包裝前1 d，按一定密度將BOSC23細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。包裝當(dāng)天，向6 cm培養(yǎng)皿中加新鮮培養(yǎng)液3 mL。用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit;Promega)。按廠家推薦的方法配制磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系混合液。取1 mL混合液逐滴加入到6 cm培養(yǎng)皿中，混勻。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。10 h后，換3 mL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染后48 h收集病毒上清。改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝技術(shù)，在相同實(shí)驗(yàn)條件下包裝MigR1病毒顆粒，改變以下條件之一，進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 A組:高質(zhì)量質(zhì)粒(經(jīng)電泳檢測(cè)僅有超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒);B組:一般質(zhì)量質(zhì)粒(經(jīng)電泳檢測(cè)超螺旋、開環(huán)和/或線性狀態(tài)共存的質(zhì)粒);C組:BOSC23細(xì)胞狀態(tài)佳 (細(xì)胞伸展、貼壁、透光性好);D組:BOSC23細(xì)胞狀態(tài)一般(細(xì)胞伸展、貼壁、透光性均一般);E組:包裝前1 d，按2.5×108/L將BOSC23細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，包裝當(dāng)天達(dá)50%～60%細(xì)胞融合;F組:包裝前1 d，按5.0×108/L將BOSC23細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，包裝當(dāng)天達(dá)70%～80%細(xì)胞融合;G組:包裝前1 d，按7.5×108/L將BOSC23細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，包裝當(dāng)天達(dá)90%～100%細(xì)胞融合。

2.3 病毒滴度測(cè)定 感染前1 d，按2.5×107/L將NIH 3T3細(xì)胞接種于12孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。感染當(dāng)天用DMEM培養(yǎng)液按1∶1比例稀釋上述制備的病毒上清，終體積為2 mL，加入聚凝胺(polybrene，hexadimethrine bromide;Sigma)至終濃度4 mg/L。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后換新鮮培養(yǎng)液，感染后48 h收獲細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽性率。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽性率及Western blotting法檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 選擇病毒滴度最高(即GFP陽性率最高)的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。包裝MigR1及BCR/ABL病毒顆粒，感染NIH 3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽性率，同時(shí)行Western blotting檢測(cè)BCR/ABL表達(dá)。BCR/ABL組移植小鼠發(fā)病時(shí)檢測(cè)其脾組織中BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)MigR1組移植小鼠脾組織。收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)100μL裂解細(xì)胞，上清經(jīng)Bradford法蛋白定量后，取30μg蛋白以8% ～12%SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的BCR或β-actin抗體，4℃過夜，再與1∶2 000稀釋的抗兔IgG-HRP室溫反應(yīng)30 min，充分洗滌后經(jīng)ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光顯色(Amersham Pharmacia Biotech)，用 LAS 4000 mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Fujifilm)。

2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清制備及小鼠骨髓細(xì)胞移植 BOSC23細(xì)胞分別包裝MigR1和p210 BCR/ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，感染經(jīng)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)處理后的供體小鼠骨髓細(xì)胞，感染后的小鼠骨髓細(xì)胞再移植入經(jīng)致死劑量X射線照射的受體小鼠體內(nèi)，流程圖見圖2。

Figure 2.Flow chart of MigR1 or BCR/ABL retroviral infection and bone marrow transplantation in mice.圖2 MigR1或BCR/ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓細(xì)胞及骨髓移植流程圖

2.6 小鼠骨髓移植后觀察指標(biāo) (1)觀察移植后小鼠狀態(tài)，包括活動(dòng)性、反應(yīng)性以及脫毛等表現(xiàn);(2)小鼠骨髓移植后2周，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血GFP陽性率;(3)移植小鼠發(fā)病垂死時(shí)，進(jìn)行小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(瑞氏-姬姆薩染色)，同時(shí)進(jìn)行對(duì)照小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類;(4)骨髓細(xì)胞分析:分離骨髓細(xì)胞，經(jīng)無菌的70μm細(xì)胞濾網(wǎng)(BD Biosciences)過濾，制備單個(gè)細(xì)胞懸液，經(jīng)TXT3細(xì)胞涂片離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)甩片，瑞氏-姬姆薩法色，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行分類;(5)肝臟和脾臟病理分析:觀察標(biāo)本大小，部分標(biāo)本用于病理檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。

結(jié) 果

1 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝技術(shù)的改進(jìn)

應(yīng)用高質(zhì)量的質(zhì)粒、BOSC23細(xì)胞狀態(tài)佳、轉(zhuǎn)染當(dāng)天70%～80%的細(xì)胞密度等條件，包裝獲得的病毒上清感染NIH 3T3細(xì)胞后的GFP陽性率均高于相應(yīng)的對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

2 MigR1及BCR/ABL病毒上清感染NIH 3T3細(xì)胞后，GFP陽性率測(cè)定及目的蛋白的表達(dá)

MigR1及BCR/ABL病毒上清稀釋2倍后分別感染NIH 3T3細(xì)胞，48 h收集NIH 3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽性率，MigR1組為 (93.99±0.83)%，BCR/ABL組為(46.95±3.13)%，有顯著差異 (P＜0.01)，見圖4A。這提示質(zhì)粒的大小是影響逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝效率的主要因素之一。同時(shí)裂解NIH 3T3細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，結(jié)果證實(shí)經(jīng)BCR/ABL病毒上清感染的NIH3T3細(xì)胞中可檢測(cè)到 BCR/ABL的表達(dá)，而經(jīng)空載體MigR1病毒上清感染的NIH 3T3細(xì)胞中則不表達(dá)BCR/ABL，見圖4B。

Figure 3.Comparison of GFP positive rates in NIH 3T3 cells infected with MigR1 retroviral supernatant under different conditions.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs regular;#P＜0.05 vs 2.5 or 7.5.圖3 不同實(shí)驗(yàn)條件下MigR1逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染NIH 3T3細(xì)胞后GFP表達(dá)的陽性率比較

Figure 4.The expression levels of GFP(A)and BCR/ABL(B)in NIH 3T3 cells after infection with MigR1 or BCR/ABL retroviral construct.Mean ± SD.n=3.＊＊ P ＜0.01 vs MigR1.圖4 MigR1和BCR/ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒上清分別感染NIH3T3細(xì)胞后，GFP及BCR/ABL蛋白的表達(dá)

3 MigR1組和BCR/ABL組移植小鼠外周血GFP陽性率及脾組織BCR/ABL的表達(dá)

小鼠分為2組，MigR1組為對(duì)照組，共9只小鼠;BCR/ABL組為實(shí)驗(yàn)組，共15只小鼠。移植2周后取小鼠外周血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞比例，MigR1組及BCR/ABL組小鼠外周血GFP陽性率分別為(63.96±9.82)%和(76.80±11.40)%，兩組之間無顯著差異 (P＞0.05)，見圖5A。BCR/ABL組小鼠發(fā)病時(shí)取小鼠脾組織做Western blotting，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。在BCR/ABL組小鼠脾組織中可檢測(cè)到BCR/ABL的表達(dá)，而MigR1組小鼠脾組織中不表達(dá)BCR/ABL，見圖5B，提示MigR1組及BCR/ABL組均移植成功。

Figure 5.The expression levels of GFP in peripheral blood(A)and BCR/ABL in spleen tissues(B)of MigR1 or BCR/ABL bone marrow transplantaion mice.Mean±SD.圖5 MigR1組和BCR/ABL組移植小鼠外周血GFP陽性細(xì)胞的比例及脾組織BCR/ABL的表達(dá)

4 移植后發(fā)病小鼠外周血計(jì)數(shù)

BCR/ABL組小鼠發(fā)病后表現(xiàn)為活動(dòng)差，脫毛，反應(yīng)差，均于19～25 d死亡，取所有發(fā)病小鼠外周血進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)檢測(cè)MigR1組小鼠外周血。與MigR1組相比，BCR/ABL組小鼠白細(xì)胞顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，見圖6。

Figure 6.The white blood cell count in MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice.Mean ± SD.＊＊ P ＜ 0.01 vs MigR1.圖6 MigR1組及BCR/ABL組發(fā)病小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)

5 外周血及骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

BCR/ABL組小鼠發(fā)病垂死時(shí)，頸椎脫臼法處死小鼠。取外周血涂片，并分離骨髓細(xì)胞，細(xì)胞涂片離心機(jī)甩片。外周血和骨髓涂片進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MigR1組小鼠外周血及骨髓各系細(xì)胞形態(tài)、比例正常。BCR/ABL組小鼠外周血涂片可見粒細(xì)胞增生活躍，比例明顯增高，以成熟粒細(xì)胞為主，并出現(xiàn)少量幼稚細(xì)胞;骨髓片見粒系增生極度活躍，以中晚幼粒及成熟粒細(xì)胞增生為主，可見少量原始粒細(xì)胞，局部區(qū)域可見嗜酸、嗜堿粒細(xì)胞，紅系及其它系增生均受抑，見圖7。

Figure 7.Peripheral blood and bone marrow smears of MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice(Wright-Giemsa staining，×1 000).圖7 MigR1組小鼠及BCR/ABL組發(fā)病小鼠外周血及骨髓片

6 肝脾病理學(xué)檢查

取MigR1組小鼠及BCR/ABL組發(fā)病小鼠的肝臟和脾臟做病理學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和MigR1組小鼠相比，發(fā)病小鼠肝臟、脾臟明顯腫大。MigR1組小鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)存在，脾臟結(jié)構(gòu)完整，紅白髓質(zhì)相間，均未見腫瘤性細(xì)胞浸潤。BCR/ABL組發(fā)病小鼠的肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，可見不同發(fā)育階段的腫瘤性粒細(xì)胞浸潤，呈巢團(tuán)狀密集分布;脾臟正常結(jié)構(gòu)破壞，為大量腫瘤性粒細(xì)胞所浸潤，見圖8。

7 2組小鼠生存狀況比較

小鼠移植后觀察180 d，MigR1組小鼠均存活，BCR/ABL組小鼠均于移植后19～25 d發(fā)病死亡，用Kaplan-Meier法比較2組小鼠生存率，見圖9，2組之間有顯著差異(P＜0.01)。

Figure 8.Histological changes of the liver and spleen of MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice(HE staining，×400).圖8 MigR1組小鼠及BCR/ABL組發(fā)病小鼠肝、脾組織學(xué)變化

Figure 9.Survival rates of MigR1 mice and BCR/ABL diseased mice compared by Kaplan-Meier method.圖9 Kaplan-Meier法比較MigR1組和BCR/ABL組小鼠的生存率

討 論

CML是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆性增生性疾病。95% 的患者骨髓中可檢測(cè)到Ph染色體和 (或)BCR/ABL融合基因［1］。研究顯示，p210 BCR/ABL具有增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性，改變了細(xì)胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲機(jī)動(dòng)蛋白的功能，從而擾亂了細(xì)胞內(nèi)正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞失去了對(duì)周圍環(huán)境的正常反應(yīng)，并抑制了凋亡的發(fā)生，是CML形成的主要分子基礎(chǔ)［2］。

動(dòng)物模型是進(jìn)行CML發(fā)病機(jī)制研究的重要工具。目前，制備CML動(dòng)物模型的方法主要有3種，即用CML細(xì)胞種植重癥聯(lián)合免疫缺陷 (severe combined immunodeficency，SCID)或非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/sever combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠的模型、BCR/ABL轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和用表達(dá)p210 BCR/ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓細(xì)胞的移植模型(p210 BCR/ABL移植模型)［3-5］。國外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用 p210 BCR/ABL已構(gòu)建了CML小鼠移植模型［3-5］，而國內(nèi)尚未見報(bào)道。我們?cè)诮梃b國外實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)了逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的大小、質(zhì)粒抽提的質(zhì)量、包裝細(xì)胞的狀態(tài)、轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞的密度等條件均可影響病毒包裝的效率。通過優(yōu)化這些條件，我們提高了包裝病毒的滴度，應(yīng)用p210 BCR/ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓細(xì)胞后進(jìn)行移植，快速地誘導(dǎo)了CML的發(fā)生，其表型類似人CML的慢性期。Western blotting檢測(cè)發(fā)病小鼠脾組織證實(shí)有BCR/ABL表達(dá)?？紤]到外源性導(dǎo)入的BCR/ABL而非小鼠自身染色體異常形成的融合基因誘導(dǎo)了CML的表型，我們未對(duì)小鼠染色體核型進(jìn)行分析。

與另外2種制備CML動(dòng)物模型的方法相比，p210 BCR/ABL移植模型潛伏期短，移植后至發(fā)病死亡僅19～25 d，外顯率高，重復(fù)性好，均為100%。而CML細(xì)胞種植免疫缺陷鼠模型中，由于小鼠的造血生長因子、黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)與人類有較大差異，人造血細(xì)胞和白血病細(xì)胞難以在小鼠體內(nèi)定植，應(yīng)用該方法制備的免疫缺陷小鼠-人CML模型存在一定的局限性。轉(zhuǎn)人造血生長因子基因的免疫缺陷鼠可望進(jìn)一步用于制備較為理想的人CML小鼠模型［6-7］。國內(nèi)也有人用EL9611紅白血病細(xì)胞進(jìn)行BALB/c鼠尾靜脈輸注建立紅白血病動(dòng)物模型的報(bào)道［8］。在BCR/ABL轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)對(duì)小鼠的胚胎有致死性。雖然通過構(gòu)建條件性轉(zhuǎn)基因小鼠模型，或選擇合適的啟動(dòng)子可克服這一難題，但BCR/ABL轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型所需的技術(shù)難度較大，周期較長，工作強(qiáng)度較大、轉(zhuǎn)基因整合率低，較難普及應(yīng)用［9-12］。因此，p210 BCR/ABL移植模型正被用于BCR/ABL致病的信號(hào)通路研究及新的治療方法的評(píng)估。

自伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼等靶向藥物相繼問世以來，針對(duì)CML患者的治療取得了巨大的進(jìn)展，開創(chuàng)了惡性腫瘤靶向治療的成功范例。然而，仍有部分患者對(duì)靶向藥物不敏感，而且部分CML患者經(jīng)靶向藥物治療后，最終還是產(chǎn)生耐藥而發(fā)生急性變，對(duì)這部分患者的治療仍面臨困難［9，13］。國內(nèi)外現(xiàn)有的研究顯示，BCR/ABL可激活多個(gè)信號(hào)通路，包括 Ras、Raf、Ras、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-specific protein kinase，Akt)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子家族(signal transducer and activator of transcription，STATs)、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL等。BCR/ABL還可干擾CML細(xì)胞的黏附和(或)遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素3(interleukin 3，IL-3)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)［1，4］。雖然進(jìn)行了大量的研究，然而BCR/ABL如何激活這些信號(hào)通路，以及信號(hào)通路的改變與CML表型間的相關(guān)性等尚不清楚，還未真正解決有效阻止CML急變及急變后的治療問題。因此，有必要在模型動(dòng)物水平進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步闡明CML的分子致病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)BCR/ABL激活的信號(hào)通路中起重要作用的結(jié)構(gòu)域以及BCR/ABL表達(dá)細(xì)胞所處微環(huán)境在腫瘤形成中的作用，尋找CML治療的潛在靶點(diǎn)。

但是，這一模型還存在不足，如3周左右即發(fā)生致死性髓系增殖性疾病，無法觀察到急變的過程。考慮到其發(fā)生致死性疾病可能是由于BCR/ABL的過表達(dá)，可通過對(duì)載體進(jìn)行修飾或其它方法，降低BCR/ABL的表達(dá)，從而延長小鼠生存期，以改良此小鼠模型，進(jìn)而觀察BCR/ABL本身及與其它相關(guān)基因共同作用對(duì)白血病的影響。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)均在我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室、生物醫(yī)學(xué)研究中心、浙江省生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及浙江大學(xué)腫瘤研究所完成，并得到了我院腫瘤中心各位醫(yī)師及技師的幫助，表示誠摯的感謝。)