云南白藥和碘仿在大鼠腭裂手術(shù)中的應(yīng)用及效果比較

梁乃銀，鄒永巍，張紅玲

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院急診科,吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

云南白藥和碘仿在大鼠腭裂手術(shù)中的應(yīng)用及效果比較

梁乃銀1，鄒永巍2，張紅玲1

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院急診科,吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

目的：探討在大鼠腭裂手術(shù)術(shù)中和術(shù)后應(yīng)用云南白藥和碘仿對(duì)傷口愈合的效果，尋找更適合于大鼠腭裂手術(shù)術(shù)中和術(shù)后應(yīng)用的藥物。方法：將90只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、碘仿組和云南白藥組，每組30只。通過(guò)手術(shù)方法在大鼠硬腭部制作腭裂缺損，并根據(jù)分組在缺損中填塞云南白藥或碘仿4 mg，對(duì)照組不填藥物。術(shù)后應(yīng)用肛門測(cè)溫法測(cè)定大鼠體溫，應(yīng)用骨密度儀檢測(cè)腭部手術(shù)區(qū)骨密度，HE染色和改良gomori特殊染色法觀察新骨形成情況，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)表達(dá)水平。結(jié)果：術(shù)后1周碘仿組大鼠體溫高于其他2組(Plt;0.05)；術(shù)后第2、3周X射線片顯示云南白藥組骨密度高于其他2組(Plt;0.05)；HE染色及改良Gomori特殊染色觀察到云南白藥組成纖維細(xì)胞分裂、增殖和新骨形成情況明顯強(qiáng)于對(duì)照組和碘仿組；術(shù)后第2、3周云南白藥組bFGF和BMP2表達(dá)水平高于其他2組(Plt;0.05)。結(jié)論：腭裂手術(shù)大鼠應(yīng)用云南白藥對(duì)體溫?zé)o刺激性升高，而且能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，減少術(shù)后腭瘺并發(fā)癥的發(fā)生，同時(shí)能夠促進(jìn)腭裂的骨性修復(fù)。

大鼠，Sprague-Dawley;腭裂；云南白藥；碘仿；骨性愈合

腭裂是一種常見(jiàn)的先天性畸形，需要手術(shù)修復(fù)腭部的解剖形態(tài),恢復(fù)腭部的生理功能[1]。傳統(tǒng)的腭裂修復(fù)術(shù)在兩側(cè)松弛切口內(nèi)填塞碘仿紗條,以達(dá)到減張、止血和防止感染的目的。但郭秀娟等[2]研究表明：在松弛切口內(nèi)填塞碘仿紗條的患者術(shù)后愈合情況不及未填塞的患者。云南白藥具有促進(jìn)血小板凝聚、收縮血管及促進(jìn)糖皮質(zhì)激素分泌作用，對(duì)炎癥過(guò)程的介質(zhì)釋放、毛細(xì)血管滲透性增強(qiáng)、結(jié)締組織增生等環(huán)節(jié)具有抑制作用。姜文[3]在腭裂修復(fù)手術(shù)中應(yīng)用云南白藥粉末,均勻撒于無(wú)菌油紗條上,用該紗條填塞于松弛切口推斷翼鉤的創(chuàng)口內(nèi)及翻瓣后滲血處，用以防止術(shù)后出血，取得了良好的臨床療效。本研究擬通過(guò)人工制造腭裂骨缺損大鼠模型，術(shù)中應(yīng)用云南白藥、碘仿，經(jīng)過(guò)測(cè)量體溫、X射線檢查、HE染色、改良gomori特殊染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)表達(dá)的方法，探討云南白藥和碘仿在大鼠腭裂術(shù)后愈合中的作用，以期發(fā)現(xiàn)更適合在腭裂手術(shù)中應(yīng)用的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只4月齡SD大鼠，體質(zhì)量(300±10) g，購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：2009-0001。

1.2 主要試劑和儀器 云南白藥由云南白藥股份公司生產(chǎn)，碘仿由天津市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，bFGF和BMP2多克隆抗體及SABC即用型免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于北京中杉生物公司;BMD400E 型骨密度儀由吉林大學(xué)第四醫(yī)院提供，石蠟切片機(jī)(Thermo公司，德國(guó))由吉林大學(xué)口腔醫(yī)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模方法 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、碘仿組和云南白藥組，每組30只。水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露大鼠上腭(腭部前3/4為硬腭,后1/4為軟腭)。根據(jù)鄒永巍等[4]的大鼠腭裂模型的制作方法：75%酒精棉球消毒大鼠口腔，在大鼠硬腭中間部,用手術(shù)刀切除長(zhǎng)度為7.0 mm、寬度為2.5 mm的腭黏膜,暴露腭骨，選鉆頭直徑為2.0 mm的電動(dòng)骨鉆去除暴露出的腭骨，去骨深度為2.0 mm、長(zhǎng)度為7.0 mm、寬度為2.5 mm (圖1，見(jiàn)插頁(yè)三)，保留鼻腔黏膜的完整性[5]。剝離子潛行分離創(chuàng)口處腭黏膜，以備拉攏縫合。在所制備的骨缺損內(nèi),根據(jù)不同的分組,分別放入云南白藥4 mg、碘仿4 mg，對(duì)照組不放任何藥物，用000縫線間斷縫合創(chuàng)口。術(shù)后1周測(cè)量大鼠體溫,觀察大鼠活動(dòng)及飲食情況。

1.4 骨密度測(cè)量 于術(shù)后2周，各組取出10只大鼠。麻醉后頸內(nèi)動(dòng)脈灌注40℃生理鹽水，排凈血液后灌注4%多聚甲醛溶液。當(dāng)頸內(nèi)靜脈斷端流出透明液體，大鼠舌頭變硬，停止灌注。取下上頜骨，放入4%多聚甲醛中固定3 d。薄片鋸切割腭骨，形成10 mm×10 mm×3 mm大小標(biāo)準(zhǔn)腭骨塊(圖2，見(jiàn)插頁(yè)三)。按照該方法，術(shù)后第3周和第4周末，各取出10只大鼠制作標(biāo)準(zhǔn)腭骨塊。采用BMD400E型骨密度儀測(cè)量3組標(biāo)準(zhǔn)骨塊的骨面密度(BMC/BW)值。

1.5 組織切片染色觀察新骨形成情況 先用甲酸氯化鋁脫鈣液將標(biāo)準(zhǔn)骨塊脫鈣3 d，然后換成20%EDTA脫鈣2周[6]。以標(biāo)本在大鼠口腔中冠狀面為石蠟切片面進(jìn)行切片，每蠟塊切片5張。每只大鼠一張石蠟切片進(jìn)行HE染色。選取另一張切片(與HE染色對(duì)應(yīng))行改良gomori特殊染色[7]。經(jīng)特殊染色，纖維組織被染成淺紅色，膠原及軟骨組織被染成藍(lán)色，骨組織及新生類骨質(zhì)被染成綠色。在顯微鏡下觀察手術(shù)區(qū)新骨形成情況。

1.6 免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)bFGF和BMP2 將剩余石蠟切片按組別分別進(jìn)行bFGF和BMP2免疫染色，并設(shè)置免疫染色對(duì)照組。免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞內(nèi)染色以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性；細(xì)胞外染色以細(xì)胞間基質(zhì)中出現(xiàn)片狀棕黃色為染色陽(yáng)性。在同一顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)下，利用Image-pro 6.0分析軟件，測(cè)定bFGF和BMP2陽(yáng)性染色吸光度(A)值，以A值表示bFGF和BMP2表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后體溫變化 第1周每天上午8：00-11：00 測(cè)量大鼠肛門體溫。腭裂術(shù)后3組大鼠體溫均有不同程度升高，碘仿組大鼠體溫明顯高于云南白藥組和對(duì)照組(Plt;0.05)。術(shù)后第3天，云南白藥組大鼠和對(duì)照組大鼠體溫均下降，而碘仿組大鼠體溫明顯升高，個(gè)別大鼠最高體溫達(dá)到40℃。見(jiàn)表1。

表1 大鼠腭裂術(shù)后1周體溫變化

*Plt;0.05 compared with control group.

2.2 各組大鼠術(shù)后腭裂愈合情況 術(shù)后第7天大鼠腭部傷口拆線。云南白藥組大鼠腭部傷口愈合皆良好，未出現(xiàn)明顯的紅腫及感染化膿現(xiàn)象。碘仿組大鼠腭部傷口紅腫，但無(wú)感染化膿。對(duì)照組大鼠腭部傷口愈合不良，傷口水腫嚴(yán)重，有3只大鼠傷口感染化膿。術(shù)后第2周，云南白藥組1只大鼠腭部傷口形成腭瘺，口腔鼻腔相通，瘺孔直徑約1.5 mm；碘仿組3只大鼠形成腭瘺，瘺孔直徑約2.5 mm；對(duì)照組5只大鼠形成腭瘺，平均瘺孔直徑3.0 mm。

2.3 骨密度測(cè)量結(jié)果 術(shù)后第2周，3組大鼠骨密度值無(wú)明顯差別；術(shù)后第3周和第4周，云南白藥組大鼠骨密度高于其他2組(Plt;0.05)。見(jiàn)表2。

表2 骨密度測(cè)量結(jié)果

Tab.2 Determination results of bone mineral density

GroupBonemineraldensity(t/week) 234Control0．328±0．0230．357±0．0250．396±0．018Iodoform0．324±0．0260．354±0．0160．398±0．021Baiyao0．327±0．0180．397±0．027?0．441±0．019?

*Plt;0.05 compared with control group.

2.4 HE染色結(jié)果 術(shù)后第2周，3組大鼠腭部缺損均為纖維結(jié)締組織填充，由大量平行或交錯(cuò)分布的膠原纖維束組成，纖維束呈均勻玻璃樣變。云南白藥組在缺損部位的外側(cè)緣可見(jiàn)類骨和成骨細(xì)胞，透明軟骨形成；碘仿組和對(duì)照組無(wú)明顯的成骨活動(dòng)；對(duì)照組部分區(qū)域可見(jiàn)輕微炎性反應(yīng)，有散在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。術(shù)后第3周，云南白藥組缺損兩端有新生骨小梁向中間延伸，有明顯類骨及成骨細(xì)胞，形成骨性骨痂(圖3A，見(jiàn)插頁(yè)三)，成骨細(xì)胞多位于成骨活躍部位，胞體呈扁橢圓形，核較大，呈橢圓狀，染色較深；碘仿組缺損兩側(cè)緣也有新生骨小梁和成骨細(xì)胞，但其中央部位仍為大量成纖維細(xì)胞和膠原纖維組織(圖3B，見(jiàn)插頁(yè)三)。術(shù)后4周，云南白藥組缺損區(qū)均為骨性骨痂填充，主要為板層骨，有骨陷窩存在，與周圍正常骨組織分界不清；碘仿組和對(duì)照組骨形成量增加，但是仍可見(jiàn)部分纖維性骨痂。

2.5 改良gomori特殊染色結(jié)果 術(shù)后第2周，云南白藥組缺損區(qū)被大量的膠原纖維充填，其中可見(jiàn)到被染成紅色的骨母細(xì)胞，周圍毛細(xì)血管豐富；碘仿組可見(jiàn)到大量成纖維細(xì)胞，胞核藍(lán)染，無(wú)明顯新骨形成(圖4A，見(jiàn)插頁(yè)三)。術(shù)后第3周，云南白藥組可見(jiàn)缺損紅染部分減少，被綠染的新生骨組織所代替(圖4B，見(jiàn)插頁(yè)三)；碘仿組和對(duì)照組藍(lán)染和紅染的部分仍然較多。術(shù)后第4周，云南白藥組骨組織呈連續(xù)性，骨膜完整，接近正常組織；碘仿組和對(duì)照組缺損未完全被骨組織充填，綠染不均勻。

2.6 bFGF染色檢測(cè)結(jié)果 大鼠腭裂術(shù)后第2～4周,云南白藥組大鼠腭骨組織bFGF表達(dá)水平高于碘仿組(Plt;0.05)，云南白藥組和碘仿組大鼠腭骨組織bFGF表達(dá)水平高于對(duì)照組(Plt;0.05)。見(jiàn)表3。

2.7 BMP2染色檢測(cè)結(jié)果 大鼠腭裂術(shù)后第2和3周，云南白藥組大鼠腭骨組織BMP2表達(dá)水平高于對(duì)照組(Plt;0.05)，碘仿組和對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。術(shù)后第4周，3組大鼠腭骨組織中BMP2表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見(jiàn)表4。

表3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)bFGF表達(dá)水平

Tab.3 Expression level of bFGF detected with immunohistochemical method(n=30,±s)

*Plt;0.05 compared with control group.

表4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BMP-2表達(dá)水平

Tab.4 Expression level of BMP2 detected with immunohistochemical method(n=30,±s)

*Plt;0.05 compared with control group.

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：腭裂術(shù)后大鼠應(yīng)用碘仿組與其他2組在體溫變化上存在顯著差別,云南白藥組和對(duì)照組術(shù)后第4天體溫接近正常，而碘仿組1周后體溫仍然高于正常;大鼠手術(shù)后體溫最高值也存在差別，云南白藥組和對(duì)照組最高體溫未超過(guò)39.5℃，而碘仿組的大鼠最高體溫達(dá)到40℃。碘仿作為發(fā)熱激活物作用于免疫細(xì)胞，可使其產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱原，再經(jīng)一系列環(huán)節(jié)引起體溫升高[8]。

腭黏膜在手術(shù)損傷后就有血管和炎癥反應(yīng)發(fā)生，凝血連鎖反應(yīng)被激活。云南白藥可以明顯促進(jìn)凝血反應(yīng)，并導(dǎo)致血小板黏附和聚集成團(tuán)[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，腭裂術(shù)后應(yīng)用云南白藥組大鼠腭部缺損區(qū)成纖維細(xì)胞增殖活躍。成纖維細(xì)胞在傷口愈合中扮演著重要角色[10]，成纖維細(xì)胞的增殖與遷移受到一系列調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)(如FGF及TGF-β)。本研究中免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：云南白藥組bFGF明顯高于其他2組。成纖維細(xì)胞成熟后可以合成彈性蛋白、纖維黏連素、黏多糖和膠原酶，這些成分在傷口愈合的后期及傷口的重新塑形中發(fā)揮重要的作用。成纖維細(xì)胞與血管一起分化形成平滑肌細(xì)胞，在傷口收縮過(guò)程中發(fā)揮作用。黏多糖是一種多聚糖復(fù)合物，在肉芽組織早期反應(yīng)中起重要作用[11]。膠原形成增加了腭黏膜的抵抗能力，防止腭瘺的發(fā)生。隨著膠原量的相應(yīng)增加，傷口的抗拉能力逐漸增強(qiáng)。故本研究中應(yīng)用云南白藥組大鼠腭瘺的發(fā)生率也明顯低于其他2組。

在諸多治療骨傷的中藥中，由三七、烏頭、重樓等組成的云南白藥對(duì)骨傷治療有著獨(dú)特的療效。楊慶秋等[12]在云南白藥促進(jìn)骨缺損修復(fù)及引導(dǎo)性骨再生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：云南白藥對(duì)骨缺損修復(fù)及引導(dǎo)性骨再生有明顯的促進(jìn)作用，這種誘導(dǎo)作用主要通過(guò)誘導(dǎo)因子對(duì)骨修復(fù)改建起重要作用[13]。許多研究[14]表明：骨誘導(dǎo)因子對(duì)骨組織的形成分化起決定性作用。在本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)檢測(cè)BMP-2結(jié)果顯示：術(shù)后第2和3周，云南白藥組BMP-2局部水平均明顯高于其他2組。研究[15]表明：BMP-2在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)新骨形成，并在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞也有著強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)活性，而且可以使誘導(dǎo)的骨細(xì)胞向確定性骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。云南白藥通過(guò)促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生BMP等因子，從而誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨愈合。

在人的腭裂手術(shù)中，一般在松弛切口中常規(guī)放置碘仿紗條，以起到止血和減張的作用。該方法在臨床上已應(yīng)用多年，成為常規(guī)治療方法。云南白藥同樣也可以制成云南白藥紗條，而且制作簡(jiǎn)便。將云南白藥均勻涂于油紗條上，就可制成云南白藥紗條。云南白藥應(yīng)用于腭裂手術(shù)，避免了碘仿的一些不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用云南白藥組大鼠術(shù)后體溫變化與對(duì)照組基本相似，說(shuō)明云南白藥無(wú)像碘仿成為致熱原，使大鼠體溫明顯增高，云南白藥也無(wú)碘仿強(qiáng)烈的刺激性氣味。腭裂手術(shù)填塞碘仿紗條的一個(gè)重要目的是止血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：云南白藥的止血作用明顯優(yōu)于碘仿，同時(shí)抗菌消炎作用也不比碘仿遜色。重要的是云南白藥可以促進(jìn)傷口的愈合，加快膠原纖維的合成，使腭裂傷口抗張能力明顯增強(qiáng)，腭瘺的發(fā)生率也就相應(yīng)降低。同時(shí)，云南白藥可以促進(jìn)BMP-2等骨形成誘導(dǎo)因子，從而促進(jìn)成骨。

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ComparisonofcurativeeffectsbetweenYunnanBaiyaoandiodoformappliedinratsaftercleftpalateoperation

LIANG Nai-yin1,ZOU Yong-wei2,ZHANG Hong-ling1,

(1.Department of Emergency,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatology Hospital, Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo study the effects of Yunnan Baiyao and iodoform for rat cleft palate operation,and to find more suitable drug for the cleft palate operation.Methods90 SD rats were randomly divided into control group,drug iodoform group,and Yunnan Baiyao group;there were 30 rats in each group.Through the method of operation,the rat cleft palate defects models were set up.According to the grouping,the 4 mg Yunnan Baiyao or 4 mg iodoform werer put into the defects,and nothing in control group.The body temperature of the rats was detected with anal temperature measurement.Bone density meter was used to detect the palate operation area bone density.HE staining and modified Gomori staining were used to observe new bone formation.The contents of bFGF and BMP2 were determined by immunohistochemical method.ResultsThe body temperature of the rats in iodoform group was higher than those in the other two groups 1 week after operation (Plt;0.05).The X-ray detection results showed that the bone density in Yunnan Baiyao group was higher than those in the other two groups 2 and 3 weeks after operation(Plt;0.05).The fibroblast division,proliferation and new bone formation were enhaced in Yunnan Baiyao group by HE and modified Gomori special staining.The contents of bFGF and BMP2 in Yunnan Baiyao group were higher than those in the other two groups 2 and 3 weeks after operation(Plt;0.05).ConclusionYunnan Baiyao has no irritation to temperature,and it can not only promote the cleft palate soft tissue healing,but also reduce palatal fistula complications,and it can promote the bony repair of cleft palate.

rats,sprague-dawley;cleft palate;Yunnan Baiyao;iodoform;bone healing

1671-587Ⅹ(2013)05-0893-05

10.7694/jldxyxb20130508

2013-03-11

吉林省科技廳科研基金資助課題(20030539)

梁乃銀(1982-)，男，天津市人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事口腔頜面部畸形治療的研究。

鄒永巍(Tel：0431-85579325,E-mail：neag@163.com)

R782.2