鹽溶法構建磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型方法的建立及評價

劉 銘，魏小蘭，陳婷梅，姜 蓉，張 健

(1.安康職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院，陜西 安康725000；2.重慶醫(yī)科大學檢驗系 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室， 重慶400016； 3.重慶醫(yī)科大學干細胞與組織工程研究室免疫組織化學室，重慶400016； 4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016)

鹽溶法構建磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型方法的建立及評價

劉 銘1，魏小蘭1，陳婷梅2，姜 蓉3，張 健4

(1.安康職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院，陜西 安康725000；2.重慶醫(yī)科大學檢驗系 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室， 重慶400016； 3.重慶醫(yī)科大學干細胞與組織工程研究室免疫組織化學室，重慶400016； 4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016)

目的：探討構建新型磨損顆粒誘導的骨溶解模型，為研究人工關節(jié)無菌性松動提供簡單、方便的實驗動物模型。方法：制備無菌鹽包埋磨損顆粒；采用隨機數(shù)字表法將50只BALB/c小鼠分為空白對照組、純鹽組、氣囊植骨組和鹽包埋磨損顆粒組，其中氣囊植骨組20只，其他各組10只；氣囊植骨組小鼠術后21 d，余3組術后14 d獲取小鼠顱骨組織標本，HE染色觀察炎細胞滲出量和骨溶解面積；掃描電鏡觀測骨片吸收陷窩面積百分比；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測破骨細胞增殖分化。結果：HE染色，與空白對照組和純鹽組比較，氣囊植骨組和鹽包埋磨損顆粒組小鼠的炎性細胞滲出量、骨溶解面積明顯增大(Plt;0.01)；與氣囊植骨組比較，鹽包埋磨損顆粒組小鼠TRAP染色破骨細胞數(shù)量明顯增多(Plt;0.01)；掃描電鏡觀察，鹽包埋磨損顆粒組小鼠骨片吸收陷窩面積百分比顯著高于氣囊植骨組(Plt;0.01)。結論：鹽溶法是一種簡單、經(jīng)濟、快速準確的構建小鼠顱骨溶解模型方法，能夠真實模擬人工關節(jié)松動發(fā)生的病理過程。

磨損顆粒；顱骨溶解；無菌松動；氣囊植骨；小鼠，近交BALBc

人工關節(jié)置換術是治療嚴重關節(jié)疾患、重塑關節(jié)功能的重要手段。隨著關節(jié)置換例數(shù)的增多，假體無菌松動的問題日趨嚴重，二次翻修治療給廣大患者帶來嚴重的經(jīng)濟和精神創(chuàng)傷[1]。任何通過有效的非手術方式來預防和治療人工關節(jié)無菌性松動一直是關節(jié)外科的研究熱點。目前研究[2]顯示：導致無菌性關節(jié)松動的主要原因是磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解。無論目前使用藥物還是靶向干預磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解現(xiàn)象，首先需建立簡單、快捷、經(jīng)濟、方便、實用性強的動物模型。目前國內(nèi)外學者使用最多的是氣囊植骨模型，該造模缺少神經(jīng)血供營養(yǎng)支持，不能真實模擬磨損顆粒在體內(nèi)誘導溶骨的真實環(huán)境，也不能真實反映骨組織在重建過程中成骨細胞的修復和破骨細胞的溶骨的動態(tài)平衡。本實驗根據(jù)鹽溶解理化特性，首次采用鹽結晶攜帶聚乙烯磨損顆粒置入部分祛除小鼠顱骨外膜的顱頂處，建立無菌松動病理模型。通過2種建模方法的比較，探討其可行性，為人工關節(jié)松動的研究提供簡潔的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 實驗選用50只近交系雌性 BALB/c 小鼠， 年齡 8～10 周，體質(zhì)量18～20 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2007-0001，使用許可證號：SYXK(渝)2007-0001。 TRAP 試劑盒購于南京建成公司；聚乙烯微粒購于美國 Zimmer 公司， 微粒直徑為2～3 μm。BX-50光學顯微鏡購于日本Olympus公司，S-3000N掃描電鏡購于日本日立公司，LEICA RM2135石蠟切片機購于德國Leica公司。

1.2 鹽結晶攜帶聚乙烯磨損顆粒的制備 5%的氯化鈉溶液2 mL，加入20 mg高分子聚乙烯顆粒，充分混合，制成10 g·L-1濃度的鹽溶液。在常溫無菌環(huán)境下(超凈臺)自然蒸發(fā)5～7 d，鹽溶液結晶。搗碎后制成鹽包埋磨損顆粒結晶體,在電子秤上分別稱出10包(51 mg/包)鹽包埋聚乙烯磨損顆粒和純鹽晶體待置。

1.3 小鼠顱骨溶解模型的制備 30只清潔無菌小鼠隨即分為空白對照組、純鹽組和鹽包埋磨損顆粒組，每組10只，稱取質(zhì)量并標記。制備4%水合氯醛，按照100 g·L-1體質(zhì)量進行腹腔麻醉，麻醉成功后，小鼠頭部用脫毛劑充分脫毛后碘伏常規(guī)消毒，鋪一次性無菌巾，在小鼠顱頂矢狀線 (垂直于小鼠雙側外耳道連線，并經(jīng)過該連線的中點)用15號小圓刀或者小剪刀切開1 cm左右皮膚及皮下組織。在助手成功對小鼠頭部皮膚牽引下，充分暴露小鼠顱頂約1 cm×1 cm范圍完整骨膜。在顱頂處，用小圓刀輕輕剝離或者15號小鑷子輕輕撕脫小鼠顱骨外膜，形成0.2 cm×0.2 cm骨膜缺損區(qū)(一般無出血，有少量出血時，用無菌紗布輕拭即可)。其中空白對照組用消毒微量取樣槍吸取5%生理鹽水50 μL，滴入骨膜缺損區(qū)即可；純鹽組放入無菌鹽顆粒51 mg，鹽包埋磨損顆粒組放入51 mg鹽包埋磨損顆粒結晶體。各組在放置鹽結晶物或者純鹽顆粒時，應盡量均勻放置在骨膜缺損區(qū)，然后用無菌、無損傷線縫合傷口。在整個手術過程中，小鼠眼睛用無菌紅霉素眼膏保護。模型構建成功，待小鼠麻醉清醒后分籠飼養(yǎng)。術后常規(guī)給予青霉素抗炎2 d，預防感染。術后14 d分別處死各組小鼠，無菌環(huán)境下取顱骨頂處骨組織(此項操作中要求取出的顱頂骨以正中矢狀線為中心的環(huán)形區(qū)域)。取出的標本用PBS液沖洗，10%中性甲醛固定24 h， 10%中性EDTA脫鈣液脫鈣 14 d，蒸餾水沖洗，70%酒精固定、石蠟包埋，切片機連續(xù)3層切片， 層厚6 μm用于HE、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。電鏡掃描：小鼠顱骨標本用生理鹽水沖洗3次，4%戊二醛固定送入電鏡室專業(yè)處理。氣囊植骨模型按照文獻[3]步驟構建，術后第21天用頸椎脫位法處死小鼠，將氣囊完整摘除，原位采集氣囊和顱骨余組織，保護軟組織和顱骨界面不受破壞，其他步驟同前。

1.4 HE染色檢測骨溶解面積和骨膜炎性反應細胞 選定切片，行常規(guī)HE染色，在 10×、20×和40× 條件下觀察顱頂骨膜炎性反應和顱骨的表面侵蝕情況， 每組選用 3個標本進行觀察，每個標本采集 5個不同的視野，采用 Image ProPlus 6.0(IPP) 圖像分析軟件測量正中矢狀線區(qū)域骨吸收溶解面積和骨外膜炎性反應細胞數(shù)。

1.5 TRAP染色檢測破骨細胞增殖分化 按照試劑盒要求對切片進行染色,染色后破骨樣細胞呈特異性棕紅色。Olympus光學顯微鏡 10×、20×和40×條件下觀察， 20×條件下攝像計算正中矢狀線區(qū)域的TRAP+細胞數(shù)量，每張片子中隨機選取 5個高倍視野，求平均數(shù)。

1.6 骨片掃描電鏡檢查 取材后按電鏡掃描要求準備，在日立S-3000N 掃描電鏡下觀察小鼠顱骨表面的骨質(zhì)吸收情況，采用 IPP 圖像分析軟件計算各組吸收陷窩面積，統(tǒng)計各組 3個標本，每個標本在200倍視野下取5個不同視野進行陷窩面積計算， 取平均值， 計算其占視野面積的百分數(shù)。

2 結 果

2.1 HE染色檢測各組骨溶解面積和骨膜炎性反應細胞 空白對照組和純鹽組小鼠骨表面溶解面積和骨膜炎性反應細胞無明顯增加，純鹽組骨膜炎性反應細胞略增高(圖1A和B，見插頁四)。鹽包埋磨損顆粒組和氣囊植骨組小鼠骨溶解面積和骨膜炎性反應細胞明顯增多(圖1 C和D，見插頁四)。IPP圖像分析軟件統(tǒng)計結果顯示：與氣囊植骨組、空白對照組和純鹽組比較，鹽包埋磨損顆粒組骨膜反應細胞數(shù)和小鼠顱骨破壞溶解面積均明顯增加(Plt;0.01)。見表1。

2.2 TRAP 染色檢測各組TRAP陽性細胞數(shù) 空白對照組和純鹽組小鼠陽性染色區(qū)域不明顯，紅染色面積小，計數(shù)細胞數(shù)量少；鹽包埋磨損顆粒組和氣囊植骨組小鼠陽性染色面積區(qū)域大，細胞數(shù)量明顯增多；鹽包埋磨損顆粒組TRAP陽性細胞數(shù)與其他3組比較明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。TRAP 染色陽性細胞統(tǒng)計結果見表2和圖2(插頁四)。

表1 各組小鼠骨膜炎性反應細胞數(shù)與骨表面溶解面積

Tab.1 Number of inflammatory cells and bone surface dissolved area of mice in various groups

GroupnNumberofinflammatorycellsDissolvedbonearea(A/mm2)Blankcontrol101540±368?0．069±0．024?Puresalt101610±535?0．073±0．012?Airbagbonegraft203163±147?0．225±0．021?Wearparticle103478±376 0．301±0．014

*Plt;0.01 compared with wear particle group.

表2 TRAP 染色陽性細胞計數(shù)

Tab.2 TRAP staining positive cell count

GroupnNumberofosteoclastsBlankcontrol103．8427±1．1821?Puresalt104．0261±1．3720?Airbagbonegraft2012．5490±1．3724?Wearparticle1017．3250±4．2107

*Plt;0.01 compared with wear particle group.

2.3 電鏡下各組小鼠骨吸收區(qū)域形態(tài)表現(xiàn)和視野面積的百分比 空白對照組和純鹽組:骨纖維組織結構緊密，鈣丟失較少，未見明顯吸收陷窩(圖3A和B)。氣囊植骨組和鹽包埋磨損顆粒組: 陷窩形態(tài)多樣，以圓形、橢圓形多見，同時可見臘腸型復合不規(guī)則性，骨吸收區(qū)凹陷形成巖溶現(xiàn)象；陷窩深淺不一，有些深的陷窩邊界清晰、底面粗糙，在陷窩中央可見片絮狀物黏附，周圍及底部可見纖維紋路；有些陷窩較淺，僅有斑點狀骨質(zhì)吸收區(qū)域，骨片表面粗糙、鈣丟失明顯，骨質(zhì)疏松嚴重；鹽包埋磨損顆粒組陷窩大小及深度、鈣丟失和骨質(zhì)疏松程度明顯強于氣囊植骨組。IPP圖像軟件分析骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比：空白對照組為(3.09±0.62)%，純鹽組為(3.25±0.78)%，氣囊植骨組為(10.27±3.17)%，鹽包埋磨損顆粒組為(14.58±2.68)%。鹽包埋磨損顆粒組骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比高于氣囊植骨組、空白組和純鹽組(Plt;0.01)。

3 討 論

本實驗通過構建體內(nèi)急性骨溶解無菌松動病理模型[4]，觀察到鹽溶法構建小鼠顱骨溶解模型在HE染色、電鏡掃描、TRAP染色以及骨膜炎性細胞滲出、骨破壞面積及破骨細胞數(shù)目變化明顯優(yōu)于小鼠背部皮下氣囊植骨模型。目前國內(nèi)外學者多采用小鼠背部皮下氣囊植骨建立的假體無菌松動急性骨溶解病理模型[5-6]。該動物模型在建模時，一方面需要使用大量價格昂貴的磨損顆粒，投入資金較多；另一方面由于該建模無血供和神經(jīng)營養(yǎng)支持、無骨組織的參與[7]，不能真實模擬磨損顆粒在體內(nèi)誘導溶骨的真實環(huán)境，亦不能真實反映骨組織在重建中成骨細胞的修復和破骨細胞的溶骨的動態(tài)平衡[8]。同樣，對于溶骨現(xiàn)象，這種制模也無法考慮骨自身的修復作用，不能準確做出溶骨定量測定。鹽溶法在磨損顆粒(直徑為2～3 μm )[9]符合誘導溶骨條件的基礎上，把鹽磨損顆?；旌辖Y晶體放置在去部分顱骨外膜處。通過鹽晶體溶解時的理化特性和顱骨黏附較為緊密，在鹽溶解過程中逐漸把適量的磨損顆粒釋放出來，較為均勻的分布在顱骨外，達到直接放置磨損顆粒的目的；另外，由于鹽溶解周圍的高滲狀態(tài)不利于細菌的生長，便于傷口修復，刺激周圍顱骨外膜迅速長入，把磨損顆粒完全包埋在骨膜下，不會出現(xiàn)磨損顆粒向周圍蔓延。該法一方面繼承皮膚縫合包埋法[10]和磨損顆粒懸浮液顱骨外膜膜下注射法[11-12]傳統(tǒng)優(yōu)點，即磨損顆粒直接和骨面接觸，符合模擬假體松動體內(nèi)骨溶解環(huán)境[13]；另一方面也克服傳統(tǒng)建模時需要磨損顆粒多、投入資金量大、制模效果不佳、取材不易和實驗動物易死亡等缺點。目前國內(nèi)外學者已經(jīng)很少使用這2種方法。鹽溶法與上述模型一樣，同樣沒有置入真正人工假體,仍然屬于急性溶骨病理模型范疇。因此在研究假體松動的過程中并沒有考慮機械應力對松動的影響，這與人工關節(jié)松動發(fā)生的慢性溶骨過程是有差別的[14]?？傊?，該實驗模型的設計克服了上述各種建模的不足，更加簡潔方便、易操作，過程嚴謹可靠， 結果合理有效， 可信度高，是值得推廣的一種基礎實驗方法 。

圖3 掃描電鏡觀察各組骨吸收情況

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Establishmentandevaluationofmouseskulldissolvementmodelinducedbywearparticleswithsaltsolutionmethod

LIU Ming1，WEI Xiao-lan1，CHEN Ting-mei2，JIANG Rong3，ZHANG Jian4

(1.Affiliated Hospital,Ankang Vocational Technical College,Ankang 725000,China;2.Key Laboratory of Clinical Laboratory and Diagnostics,Ministry of Education，Department of Laboratory，Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3.Department of Immunohistochemistry，Stem Cells and Tissue Engineering Laboratory,Chongqing Medical University,Changqing 400016,China; 4.Department of Orthopedics， First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University，Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo build a new type of wear particle induced bone dissolution model,and to provide a simple and convenient aseptic loosening experimental animal model for the study of artificial joints.MethodsA total of 50 BALB/c mice were randomly divided into blank control group,pure salt group(n=10),airbag bone graft group(n=10),and salt embedding wear particle group(n=10).The skull bone samples of mice in airbag bone graft group and other groups were obtained 21 and 14 d after operation,respectively.The number of inflammatory cells and osteolysis area were observed by HE staining.The percentage of bone absorption lacuna area was detected by scanning electron microscope.The proliferation and differentiation of osteoclasts were observed by TRAP stainingResultsThe HE staining results showed that compared with airbag bone graft group and black group, the efflux of inflammatory cells and osteolysis areas in pure salt group and wear particle group were increased significantly (Plt;0.01). The TRAP staining results showed that the number of osteoclasts in airbag bone graft group was significantly lower than that in wear particle group (Plt;0.01).The scanning electron microscope results showed that the percentage of bone absorption lacuna area in wear particle group was significantly higher than that in airbag bone graft group (Plt;0.01).ConclusionSalt solution method is a simple,economic,and fast method to build myuse skull dissolvement models,and it can accurately simulate the pathological process of aseptic loosening after artificial joint replacement.

wear particle; skull dissolution; aseptic loosening;air pouch model；mice,inbred BALBc

1671-587Ⅹ(2013)05-1041-04

10.7694/jldxyxb20130537

2013-03-28

重慶市科委研究專題資助課題(CSTC,2010AB5094)；重慶市科技攻關計劃項目資助課題(CSTC2010AB5094)

劉 銘(1976-)，男， 陜西省安康市人，主治醫(yī)師，在讀醫(yī)學碩士，主要從事人工關節(jié)感染與松動研究。

張 健(Tel:023-89011202，E-mail:68733235@sohu.com)

R-332

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