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    甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗對(duì)小鼠的免疫原性觀察①

    2013-11-28 02:03:46郭世杰閆昆明嚴(yán)超英王明惠王飛宇傅連弟
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:血凝素針組中和

    劉 英 郭世杰 閆昆明 嚴(yán)超英 王明惠 王飛宇 傅連弟 韓 軍

    (吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科,長(zhǎng)春130021)

    流感是最為嚴(yán)重的呼吸道傳染病之一,在世界范圍內(nèi)造成極高的發(fā)病率和死亡率[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道,流感的流行每年在全球造成約300萬(wàn)至500萬(wàn)例嚴(yán)重疾病和約25萬(wàn)至50萬(wàn)例死亡,嚴(yán)重威脅人類的生命健康[2]。目前,接種流感病毒疫苗被認(rèn)為是預(yù)防流感發(fā)生與控制病毒傳播的最佳方法[3]。迄今為止,尚無(wú)國(guó)產(chǎn)的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗上市。為評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗對(duì)小鼠的免疫效果,我們將大連雅立峰生物制藥有限公司研制的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 病毒 本試驗(yàn)所用甲型H1N1流感病毒來(lái)源于英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所(NIBSC)。

    1.2 疫苗 由大連雅立峰生物制藥有限公司研制的甲型 H1N1流感病毒亞單位疫苗,共 9批:Y20120401、Y20120402、Y20120403 含血凝素 20 μg/ml;Y20120404、Y20120405、Y20120406 含血凝素30 μg/ml;Y20120407、Y20120408、Y20120409 含血凝素 40 μg/ml。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及雞胚 清潔級(jí)昆明小鼠190只,12~14 g,購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;10日齡健康雞胚,來(lái)源于封閉飼養(yǎng)的健康雞群。

    1.4 主要試劑 霍亂弧菌濾液(菌液):購(gòu)自Sigma公司;1%紅細(xì)胞懸液:由新鮮的雞血球配制而成;壓積血球:將新鮮雞血經(jīng)PBS緩沖溶液或生理鹽水洗滌離心后,取下層沉淀血球即得;4個(gè)血凝單位抗原的配制:將已知血凝滴度的甲型H1N1毒種稀釋為4個(gè)血凝單位的病毒懸液。

    1.5 動(dòng)物分組及免疫 將9批疫苗分別免疫小鼠,腹腔注射0.5 ml/只,每批疫苗又分為1針組、2針組,每組10只,2針免疫間隔1周,同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不予免疫)。首針免疫21天后,分別采血,分離血清,同組混合進(jìn)行血凝抑制抗體和中和抗體的測(cè)定。

    1.6 血凝抑制(HI)抗體的測(cè)定 取待檢血清25 μl,加入霍亂弧菌濾液(去除血清中的非特異性抑制素,此物質(zhì)能夠與紅細(xì)胞表面受體結(jié)合,影響HI效價(jià)的判定)100 μl,37℃水浴16 小時(shí)后,56℃水浴50分鐘,滴入壓積血球,4℃冰箱中和2小時(shí),離心后取上清。在“U”孔板上從1∶5倍起進(jìn)行對(duì)倍稀釋,稀釋后每孔均加入25 μl 4個(gè)血凝單位抗原,室溫放置60分鐘。每孔加入1%紅細(xì)胞懸液25 μl,振蕩均勻后,置室溫40分鐘觀察結(jié)果,以能完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高血清稀釋度的倒數(shù)為血凝抑制抗體的效價(jià),HI抗體效價(jià)≥1∶40為陽(yáng)轉(zhuǎn)。

    1.7 中和抗體的測(cè)定 將待檢血清經(jīng)霍亂弧菌濾液常規(guī)處理后進(jìn)行稀釋至1∶640,然后分別與100EID50病毒液等量混合,置室溫中和1小時(shí),中和后立即接種10日齡雞胚,每個(gè)稀釋度接種4只,每只0.2 ml,置 33 ~35℃ 培養(yǎng) 72小時(shí),冷胚,取尿囊液做直接血凝,以雞胚尿囊液發(fā)生紅細(xì)胞凝集為陽(yáng)性,并以出現(xiàn)2個(gè)雞胚發(fā)生感染的最高血清稀釋度的倒數(shù)為血清中和抗體的效價(jià),中和抗體效價(jià)≥1∶200為陽(yáng)轉(zhuǎn)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用幾何均數(shù)計(jì)算各試驗(yàn)組小鼠的平均血凝抑制抗體效價(jià),雞胚半數(shù)感染法判定中和抗體效價(jià)。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多因素方差分析,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組血凝抑制(HI)抗體效價(jià)比較 不同免疫次數(shù)的各組小鼠,健康狀況均良好,體重均增加。血凝素含量為20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組 HI抗體效價(jià)均小于1∶40(F=1.77,P >0.05)。HI抗體效價(jià)≥1∶40 為陽(yáng)轉(zhuǎn),故血凝素含量為20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗免疫1針組、2針組小鼠均未陽(yáng)轉(zhuǎn)。血凝素含量為30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組的HI抗體效價(jià)均大于1∶40(F=59.85,P <0.01),血凝素含量為 30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組和2針組的血凝抑制抗體效價(jià)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.67,P >0.05,見(jiàn)表1)。

    2.2 各組中和抗體效價(jià)比較 血凝素含量為20μg/ml的流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組的中和抗體效價(jià)均小于 1∶200(F=2.39,P >0.05);血凝素含量為30、40 μg/ml的流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組的中和抗體效價(jià)均大于1∶200(F=62.15,P <0.01),血凝素含量為 30、40 μg/ml的流感病毒亞單位疫苗1針組和2針組的中和抗體效價(jià)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.49,P >0.05),見(jiàn)表2。

    表1 各組免疫小鼠血清的HI抗體水平Tab.1 Serum HI antibody titers of all groups

    表2 各組免疫小鼠血清的中和抗體水平Tab.2 Serum neutralizing antibody titers of all groups

    3 討論

    目前國(guó)際上人用流感疫苗的研究技術(shù)已較成熟,先后發(fā)展了多種疫苗制備技術(shù),包括全病毒流感疫苗、裂解流感疫苗、亞單位流感疫苗,有效控制了流感疫情的傳播。國(guó)內(nèi)外的臨床研究均表明,流感病毒亞單位疫苗相比全病毒疫苗和裂解疫苗,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化,具有更高的純度,不含流感病毒基質(zhì)蛋白和核蛋白,在良好地保留了免疫原性的前提下,接種后副反應(yīng)更為輕微,尤其適用于兒童[4,5]。

    與流感病毒侵襲力及免疫保護(hù)力相關(guān)的流感病毒的抗原主要有血凝素(Hemagglutinin,HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)、核蛋白(Nuclear protein,NP)和基質(zhì)蛋白 (Matrix protein,M)等[6]。研究表明,血凝素是流感病毒亞單位疫苗的有效免疫成分[7-9]。血凝素抗體能中和病毒,是最主要的保護(hù)性抗體[10]。因此,大連雅立峰生物制藥有限公司研制了以血凝素為有效免疫成分的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗。通過(guò)對(duì)不同血凝素含量的流感病毒亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生的血凝抑制抗體效價(jià)、中和抗體效價(jià)之間的比較,血凝素含量為30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗的免疫效果能夠達(dá)到設(shè)定標(biāo)準(zhǔn),即血凝抑制抗體效價(jià)>1∶40,中和抗體效價(jià)>1∶200,并且均明顯優(yōu)于血凝素含量為20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗。同時(shí),通過(guò)對(duì)不同免疫次數(shù)的比較,血凝素含量為30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組和2針組對(duì)小鼠的免疫原性無(wú)差異,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論表明甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗血凝素含量直接影響其免疫原性,且血凝素含量為30 μg/ml接種1針即可達(dá)到理想的免疫效果。

    本研究證實(shí)大連雅立峰生物制藥有限公司研制的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗具有較好的動(dòng)物免疫原性,為國(guó)產(chǎn)流感亞單位疫苗的臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

    1 Palese P.Influenza:old and new threats[J].Nat Med,2004;10(12 Suppl):S82-87.

    2 World Health Organization.Seasonal influenza[OL].http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html,2011(03);17.

    3 徐 偉,翟力軍,崔德軍et al.醫(yī)務(wù)人員計(jì)劃接種季節(jié)性和甲型H1N1流感疫苗情況調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志,2010;3l(6):714-715.

    4 Gerdil C.The annual production cycle for influenza vaccine[J].Vaccine,2003;21(16):1776-1779.

    5 董蒲梅,李玉秦,鄭天柱et al.流行性感冒滅活亞單位疫苗和裂解疫苗的安全性和免疫原性的比較研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2003;24(7):570-573.

    6 Taubenberger J K,Morens D M,Influenza:the once and future pandemic[J].Public Health Rep,2010;125(Suppl 3):16-26.

    7 Wang C C,Chen J R,Tseng Y C et al.Glycans on influenza hemagglutinin affect receptor binding and immune response[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009;106(43):18137-18142.

    8 Van Damme P,Arnou R,Kafeja F et al.Evaluation of non-inferiority of intradermal versus adjuvanted seasonal influenza vaccine using two serological techniques:a randomised comparative study[J].BMC Infect Dis,2010;10:134.

    9 Gildea S,Arkins S,Walsh C et al.A comparison of antibody responses to commercial equine influenza vaccines following annual booster vaccination of National Hunt horses-a randomised blind study[J].Vaccine,2011;29(22):3917-3922.

    10 邵惠訓(xùn).流感疫苗的現(xiàn)狀與未來(lái)[J].國(guó)際病毒學(xué)雜志,2010;17(4):110-115.

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