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    八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠脾T細(xì)胞及血清細(xì)胞因子的影響①

    2013-11-27 11:15:50陳育民陳曉潔劉曉霞王雪玲陳雪皎河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院邯鄲056029
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2013年11期
    關(guān)鍵詞:荷瘤亞群細(xì)胞因子

    陳育民 陳曉潔 劉曉霞 王雪玲 陳雪皎 (河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院,邯鄲056029)

    惡性腫瘤是危害人類(lèi)健康和生命的嚴(yán)重疾病之一。目前,化學(xué)治療是腫瘤治療中必不可少的手段之一,但單純化療常引起免疫抑制,導(dǎo)致惡性反復(fù)感染,機(jī)體衰弱,時(shí)常出現(xiàn)各種不同程度的毒副反應(yīng)、預(yù)后不良而加速患者的死亡。環(huán)磷酰胺(CTX)作為臨床常用的化療藥物,對(duì)免疫系統(tǒng)有抑制作用,T細(xì)胞也在被抑制之列,而T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗腫瘤的主力[1],故化療后腫瘤患者的抗腫瘤能力降低,無(wú)法自我徹底清除體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞,使其應(yīng)用受到一定的限制。因此,尋找能夠逆轉(zhuǎn)化療對(duì)T細(xì)胞抑制的藥物,將有助于臨床上更好開(kāi)展化療治療腫瘤。

    八珍湯源自《正體類(lèi)要》,是四君子湯和四物湯的復(fù)方。四君子湯能健脾益氣,四物湯可補(bǔ)血養(yǎng)血,八珍湯能匯兩方之功,奏兩方之效,為氣血雙補(bǔ)的經(jīng)典方。臨床上常用于內(nèi)科、婦科上的病后失調(diào)、久病失治、失血過(guò)多等慢性消耗性疾病的治療。近年來(lái),中藥日益受到重視,八珍湯作為中國(guó)古方的經(jīng)典方,其對(duì)免疫系統(tǒng)的藥理作用近年來(lái)已有報(bào)道,但對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的影響還未見(jiàn)報(bào)道。故本研究探討了八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖、T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的影響,為臨床上輔助治療腫瘤提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物及瘤株 健康昆明小鼠,雌雄各半,體重18~22 g,由河北工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。S180腫瘤細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心饋贈(zèng)。

    1.1.2 藥物 八珍湯(一副)包括:當(dāng)歸10 g,川芎5 g,白芍 8 g,甘草 5 g,熟地黃 15 g,人參 3 g,白術(shù)10 g,茯苓8 g。均購(gòu)自邯鄲市中醫(yī)院中藥房,經(jīng)河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理室鑒定。將所有藥材水中浸泡0.5小時(shí),加入大約為藥材體積10倍的水,煮沸1小時(shí),濾出藥液;再加5倍體積的水,煮沸0.5小時(shí),濾出藥液。兩次藥液合并,水浴蒸發(fā)至終濃度為2 g生藥/ml的藥液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.3 試劑 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI1640培養(yǎng)基、ConA為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠CD8均為eBioscience公司產(chǎn)品;小鼠IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒為伊萊瑞特生物科技有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥 取腹腔內(nèi)傳代7天的肉瘤S180小鼠,脫臼處死小鼠,在無(wú)菌條件下抽取腹腔內(nèi)瘤細(xì)胞,并以生理鹽水洗滌3次,2 500 r/min離心3分鐘,棄上清液,用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為5×106ml-1,接種于小鼠右腋窩皮下(0.2 ml/只)。接種24小時(shí)后隨機(jī)分為3組,每組10只,分別為模型組、CTX組、八珍湯+CTX組。另取10只正常小鼠作為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型組腹腔注射生理鹽水0.1 ml/(10 g·d),連續(xù)3天,CTX組和八珍湯+CTX組腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)0.1 ml/(10 g·d),連續(xù)3天。自第4天始,正常對(duì)照組、模型組和CTX組用生理鹽水0.2 ml/(10 g·d)灌胃,八珍湯+CTX組用八珍湯0.2 ml/(10 g·d)灌胃,連續(xù)10天。末次給藥后2小時(shí)進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

    1.2.2 MTT法檢測(cè)八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖的影響 處死小鼠,無(wú)菌取脾,制備脾細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞在95%以上。用完全RPMI1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞懸液調(diào)配成細(xì)胞濃度2×106ml-1的單細(xì)胞懸液。取已制備的脾細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中,100 μl/孔,每個(gè)樣本做6個(gè)孔。其中3孔加ConA液(0.1 mg/ml)100 μl,使其終濃度為5 μg/ml,另3孔作為對(duì)照。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。于實(shí)驗(yàn)終止前每孔加入5 g/L MTT 20 μl,振蕩器上振蕩10分鐘,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入100 μl DMSO,振蕩10分鐘,使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組平均A值 /對(duì)照組平均A值)×100%。

    1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響 取100 μl已制備的脾淋巴細(xì)胞懸液于EP管中,4℃、1 500 r/min離心5分鐘,加入冷 PBS 1 ml,離心,棄上清,加冷凍 PBS 100 μl,并按說(shuō)明加入 PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠 CD8,4℃避光孵育30分鐘,加入 PBS1 ml,離心,棄上清,加入 500 μl PBS,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.2.4 ELISA檢測(cè)八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響 末次給藥后2小時(shí),各組小鼠球后靜脈叢采血,每只取血0.8~1 ml,分離血清,并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本的OD值減去空白孔的OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),以平滑曲線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn),通過(guò)標(biāo)本的OD值在曲線上查出其對(duì)應(yīng)濃度。IL-2/IFN-γ(μg/L)=標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的濃度×稀釋倍數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果以±s表示,兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖的影響

    用MTT法檢測(cè)各組T細(xì)胞經(jīng)ConA刺激72小時(shí)后的增殖能力,由圖1可見(jiàn)各組荷瘤小鼠的T細(xì)胞增殖能力顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01),CTX組T細(xì)胞增殖能力明顯低于模型組(P<0.01),八珍湯+CTX組T細(xì)胞增殖能力明顯高于CTX組(P<0.01),與模型組相比沒(méi)有顯著性差異,但有增高趨勢(shì)(P>0.05)。

    表1 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響(±s,%)Tab.1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s,%)

    表1 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響(±s,%)Tab.1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s,%)

    Note:Compared with normal control group,1)P <0.01;compared with model group,2)P <0.01;compared with model group,3)P <0.05;compared with CTX group,4)P <0.01.

    7±4.29 1.59±5.06 Model 10 40.21±4.711) 23.89±6.321) 12.51±3.651) 1.82±3.271)CTX 10 24.26±7.281)2) 15.60±4.931)2) 7.46±3.011)2) 1.92±2.351)Bazhen decoction+CTX 10 34.93±4.241)3)4) 19.46±5.041)3)4) 10.48±4.841)3)4) 1.79±4.831)CD4/CD8 Normal control 10 47.43±7.08 28.25±3.12 17.1 Groups n CD3+T CD3+CD4+T CD3+CD8+T

    圖1 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞增殖能力的影響Fig.1 Effect of Bazhen decottion on proliferation of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy

    2.2 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群的影響由表1可見(jiàn),各荷瘤小鼠組的T細(xì)胞亞群明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01),而CD4/CD8比值明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。CTX組的T細(xì)胞亞群與模型組相比顯著降低(P<0.01)。八珍湯+CTX組的T細(xì)胞亞群明顯高于CTX組(P<0.01),但仍低于模型組(P<0.05)。各荷瘤小鼠組CD4/CD8比值均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

    2.3 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響 ELISA測(cè)得各組小鼠血清細(xì)胞因子的結(jié)果如表2所示:各荷瘤小鼠組血清中IFN-γ、IL-2的含量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01),CTX組荷瘤小鼠血清中 IFN-γ、IL-2含量明顯低于模型組(P<0.01),八珍湯+CTX組小鼠血清IFN-γ、IL-2含量明顯高于CTX組(P<0.01),而與模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

    表2 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響(μg/L,±s)Tab.2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L,±s)

    表2 八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影響(μg/L,±s)Tab.2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L,±s)

    Note:Compared with normal control group,1)P <0.01;compared with model group,2)P <0.01;compared with CTX group,3)P<0.01.

    Groups n IFN-γIL-2 Normal control 10 10.276±6.953 9.841±2.618 Model 10 7.702±7.0161) 6.914±3.9081)CTX 10 4.260±3.5621)2) 4.012 1±5.2831)2)Bazhen decoction+CTX 10 7.329±3.7081)3) 7.025±2.9671)3)

    3 討論

    腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病,目前除手術(shù)外,化學(xué)療法是治療腫瘤的主要手段,但它在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)殺傷正常細(xì)胞,對(duì)機(jī)體的免疫功能全面抑制,使機(jī)體免疫功能低下。而T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能低下在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。故機(jī)體T細(xì)胞的狀況能夠反映機(jī)體抗腫瘤的能力。因此如何提高化療后機(jī)體T細(xì)胞功能是腫瘤治療的一個(gè)重要內(nèi)容。

    國(guó)內(nèi)已將中草藥用于防治化療毒副作用方面[2-4]。八珍湯源自《正體類(lèi)要》,是四君子湯和四物湯的復(fù)方。四君子湯能健脾益氣,四物湯可補(bǔ)血養(yǎng)血,八珍湯能匯兩方之功,奏兩方之效,為氣血雙補(bǔ)的經(jīng)典方。臨床上常用于內(nèi)科、婦科上的病后失調(diào)、久病失治、失血過(guò)多等慢性消耗性疾病的治療。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)八珍湯能夠解除TGF-β1對(duì)T細(xì)胞增殖和活化的抑制作用[5]。本文從下述指標(biāo)觀察了八珍湯對(duì)化療后荷瘤小鼠T細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響。

    在體外研究中,T細(xì)胞經(jīng)特異性抗原或非特異性抗原,如ConA等的誘導(dǎo),會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化增殖。因此,常將T細(xì)胞的增殖反應(yīng)作為評(píng)價(jià)T細(xì)胞功能,反映機(jī)體免疫狀況的指標(biāo)[6]。T細(xì)胞按表面CD分子的不同分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞,參與抗腫瘤免疫的主要是CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫,故T細(xì)胞亞群是反映機(jī)體抗腫瘤能力的一個(gè)常用指標(biāo)。IFN-γ是活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多潛能的細(xì)胞因子,對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,它可以激活巨噬細(xì)胞,促進(jìn)MHC分子表達(dá)和抗原提呈,誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化,抑制Th2細(xì)胞分化,從而促進(jìn)細(xì)胞免疫功能[7]。IL-2主要由活化的細(xì)胞產(chǎn)生,是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最主要的細(xì)胞因子之一。它能刺激T細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,促進(jìn)CTL細(xì)胞的功能。故IFN-γ和IL-2不僅能反映T細(xì)胞的功能,而且在一定程度上也能反映機(jī)體的免疫水平,在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[8]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:八珍湯能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖,提高CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例,特別是CD8+T細(xì)胞比例,促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2。故可知八珍湯可促進(jìn)T細(xì)胞功能,提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力。

    因此,本研究為臨床上將八珍湯用于改善化療所致機(jī)體免疫功能低下提供了理論依據(jù)。但有關(guān)八珍湯的給藥時(shí)間、用藥時(shí)間長(zhǎng)短等問(wèn)題需要進(jìn)一步探討。

    1 金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008;214-215.

    2 胡志明,邱錫謙,曾玉芬.扶正排毒通腸湯治療惡性腫瘤化療毒副作用60例[J].江西中醫(yī)藥,2011;42(338):25-26.

    3 古紅莉.參麥注射液減輕惡性腫瘤化療毒副作用60例臨床觀察[J].新中醫(yī),2008;40(10):20-21.

    4 邵青偉,葛 熙.參芪扶正液預(yù)防癌癥化療所致毒副作用的觀察與護(hù)理[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010;14(10):17-18.

    5 劉曉霞,陳劍華,陳育民et al.八珍湯對(duì)TGF-β1抑制的T淋巴細(xì)胞增殖及其活化影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009;25(11):1053-1055.

    6 呂世靜.臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)[M].第2版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010;165-166

    7 金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008;60-61.

    8 金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008;252-253.

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