雞胚發(fā)育過程四種放射狀膠質(zhì)細胞標記物的對比分析①

杜 蕊 楊慈清 李玲玲 段明慧 盧 習 陳樹林 趙善廷

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊陵712100)

禽類視頂蓋(Optic tectum)具有明顯分層結(jié)構(gòu)，在其層的形成過程中，RGCs對神經(jīng)元的遷移起著重要作用[1]。禽類神經(jīng)元(Neuron)的遷移方式主要有2種，分別為放射狀遷移(Radial migration)和切向遷移(Tangential migration)[2]。其中神經(jīng)元的放射狀遷移主要有2種方式，依賴于放射狀膠質(zhì)細胞的遷移[3](Glia-guided locomotion)和不依賴膠質(zhì)細胞的胞體位移式遷移[4](Glia-independent somal translocation)。放射狀膠質(zhì)細胞是一種短暫存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)發(fā)育過程中的細胞，為第一種遷移的神經(jīng)元提供“腳手架”。BLBP、RC2和Nestin是研究脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)RGCs的三種常用的標志物。BLBP最先從小鼠的腦中分離獲得，是脂肪酸結(jié)合蛋白家族(Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)的成員，是一種分子量小、高度保守的細胞質(zhì)蛋白，它特異表達于發(fā)育中的脊椎動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中尤其是在發(fā)育中的CNS的RGCs及成熟小腦中貝格曼膠質(zhì)細胞(Bergmann glial cell)[5，6]。RC2 可以識別位于腦室壁可轉(zhuǎn)化為星形膠質(zhì)細胞的不同水平的RGCs，還可以識別脊髓中的假單極神經(jīng)元，小腦中貝格曼膠質(zhì)細胞的前體細胞，以及位于神經(jīng)上皮中具有放射狀雙極細胞形態(tài)的一類神經(jīng)元等[7]。Nestin屬于第4類中間絲蛋白(Intermediate filament protein，IFP)，被認為是一種神經(jīng)干細胞(Neural stem cell，NSC)的標記物，并且在進化上高度保守[8]。GFAP最早在多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)病人的膠質(zhì)瘢痕中分離出來[9，10]。目前，GFAP 被認為是星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte)的特異性標志物。在發(fā)育中禽類視頂蓋結(jié)構(gòu)的研究經(jīng)常被用來標記膠質(zhì)細胞，本試驗通過對4種標記物在視頂蓋發(fā)育過程中標記的細胞進行比較，說明這4種膠質(zhì)細胞的標記物所標記的細胞存在一定差異，該結(jié)果可為禽類視頂蓋發(fā)育過程膠質(zhì)細胞標記的研究提供理論基礎。星形膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應關(guān)系密切，研究其前體細胞即放射狀膠質(zhì)細胞對于研究免疫反應的機理具有重要理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 新鮮種雞蛋(當?shù)胤N雞場);一抗Mouse anti RC2 IgM(Millipore);Rabbit anti BLBP(Millipore);Rabbit anti GFAP(Millipore);Mouse anti Nestin(Millipore);二抗 Donkey anti Rabbit-488(Millipore);Goat anti Mouse-568 IgM(Millipore);Goat anti Mouse-568(Millipore);Observer-Z1結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(德國 Zessi公司);VT1000S振蕩切片機(德國Leica公司);ECM 830電轉(zhuǎn)儀(美國BTX公司);HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司);B18型科裕微電腦全自動孵化箱(德州市科裕孵化設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 雞胚胎培養(yǎng) 從種雞場購買新鮮受精雞蛋當天帶回實驗室，用37℃溫水洗凈，酒精棉球擦干凈并晾干，大頭向上放入孵化器中，溫度37.8℃，濕度60%，轉(zhuǎn)蛋間隔2小時。在發(fā)育到E8、E10、E12、E14、E16、E18分別取材，每個時期取3個胚胎。

1.2.2 活體原位電轉(zhuǎn) 胚胎發(fā)育至E4.5-E5將2 μg/μl的pCAG-GFP質(zhì)粒0.5 μl在體視顯微鏡下用玻璃微電極注射到視頂蓋的腦室腔內(nèi)，質(zhì)粒工作液中質(zhì)粒與0.1%的Fast Green(Sigma)溶液以10∶1的比例混合均勻，針狀電極放在已注射質(zhì)粒的視頂部位兩側(cè)，陽性電極在擬轉(zhuǎn)基因一側(cè)，確保電極與組織之間有一定空隙，使用BTX電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)電壓25 V，脈沖時間50 ms，脈沖間隔950 ms，電脈沖6次，電擊后用醫(yī)用膠布密封開口，整個過程在無菌操作工作臺內(nèi)完成，放回恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。到胚胎發(fā)育的E8、E10和E12進行取材。

1.2.3 固定和切片 將取下的雞胚胎斷頭，將頭放入4%多聚甲醛(PFA)于室溫下在搖床搖晃固定3天，期間每天換一次4%PFA。將固定好的胚胎頭部在體視顯微鏡下將整個腦取出，切下視頂蓋部分用4℃預冷的0.1 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PB)洗滌2～3次，用吸水紙將多余溶液吸干。用4%瓊脂糖包埋，修整組織塊，用強力膠將組織塊粘在振蕩切片機的載物臺上，冠狀切片，切片厚度為80 μm。

1.2.4 免疫熒光技術(shù)染色 將6個不同時期(E8、E10、E12、E14、E16、E18)的切片置于 24 孔培養(yǎng)板中，每孔放入3～4個切片，作為一個樣本，采用漂浮染色法染色。用4℃預冷的0.1 mol/L PB漂洗3次，5 min/次，吸出孔內(nèi)PB液體，分別加入1∶1 000稀釋的 Mouse anti RC2 IgM、Rabbit anti BLBP、Mouse anti Nestin和 Rabbit anti GFAP一抗，每孔 300 μl，4℃冰箱內(nèi)振蕩過夜，用0.1 mol/L PB漂洗3次，30分鐘/次，分別加入1∶300稀釋的 Donkey anti Rabbit-488、Goat anti Mouse-568 和 Goat anti Mouse-568 IgM，每孔300 μl，4℃冰箱內(nèi)振蕩過夜，用0.1 mol/L PB漂洗3次，30 min/次，將染好的切片用抗熒光淬滅的封片劑封片。

1.2.5 觀察和拍照 結(jié)構(gòu)照明顯微鏡觀察拍照，用Photoshop CS5軟件處理圖片。分析不同發(fā)育時期BLBP、RC2、Nestin和GFAP的RC的表達情況及RC的形態(tài)學特點。

2 結(jié)果

圖1 雞胚胎視頂蓋不同發(fā)育時期4種膠質(zhì)細胞標記物的表達Fig．1 Expression of 4 glial cell markers in chicken embryonic optic tectum at different developmental stages from E8 to E18

圖2 雞胚胎視頂蓋不同發(fā)育時期膠質(zhì)細胞的形態(tài)學特點Fig．2 Morphological characteristics of the glial cells in chicken embryonic optic tectum at different developmental stages

2.1 雞胚胎視頂蓋不同發(fā)育時期4種膠質(zhì)細胞標記物的表達分布 從E8-E18，4種標記物均可標記RGCs，但表達強度有差異。BLBP從E8開始逐漸增強(圖1A)，E12-E16達到高峰(圖1C-E)，E18開始下降(圖1F)。在E8-E18，BLBP標記的RGCs，胞體主要位于室管膜層(Ventricular zone，VZ)。而在E14-E18，除胞體位于VZ的RGCs外還出現(xiàn)了一些胞體離開VZ，隨機分布于視頂蓋的各層的細胞(白色箭形所示)(圖1D-F)。這樣的RGCs在E14開始出現(xiàn)(圖1D)，E16達到高峰(圖1E)后開始降低，到E18，位于視頂蓋各層的BLBP表達水平明顯降低(圖1F)。從 E8-E16，RC2均可標記 RGCs(圖1GL)，但表達強度有差異。RC2從E8開始表達(圖1G)，E10-E12持續(xù)增強(圖1H-I)，從E14開始表達逐漸減弱(圖1J)，E16-E18對RGCs染色不明顯(圖1K-L)。在E8時，RC2除特異性染出放射狀排列的RGCs(白色箭形頭所示)外，還可染出頂蓋延髓束(Tectobulbar efferents，TE)的纖維(白色箭形所示)(圖1G)。在E10和E12可以清晰看到放射狀排列的RGCs的頂突起(Apical process)(白色箭形頭所示)，此時RC2的表達強度最強(圖1H-I)。E14開始RC2的表達明顯減弱，但仍可以觀察到放射狀排列的RGCs的頂突起(白色箭形頭所示)(圖1J)，而到了E16，RGCs中RC2的表達持續(xù)降低，在表面灰質(zhì)纖維層(Stratum griseum et fibrosum superficiale，SGFS)還能觀察到RGCs(圖1K)，在E18，RC2表達不明顯(圖1L)。與RC2類似，從E8-E16，Nestin均可標記 RGCs(圖1M-Q)，但表達強度仍有差異。Nestin從E8開始表達(圖1M)，E10-E12表達持續(xù)增強(圖1N-O)，從 E14開始減弱(圖1P)，在 E16時Nestin表達繼續(xù)降低(圖1Q)，到 E18時 Nestin表達已不明顯(圖1R)。與RC2不同，從E10-E14，在中央灰質(zhì)層(Stratum griseum central，SGC)可明顯觀察到Nestin陽性的神經(jīng)元(白色箭形所示)，并且從E10開始表達(圖1N)，E12-E14表達最強(圖1O-P)，E16表達開始減弱(圖1Q)，E18時，SGC層的神經(jīng)元表達Nestin已經(jīng)不明顯(圖1R)。從E8-E16，GFAP均可標記 RGCs，但 GFAP表達較弱，且E8-E14表達強度無明顯變化(圖1S-V)，在E16和E18表達增強。在 E18，GFAP標記明顯增強(圖1X)，在視神經(jīng)層(Stratum opticum，SO)、中央白質(zhì)層(Stratum album central，SAC)和室周灰質(zhì)層(Stratum griseum periventriculare，SGP)尤為明顯(白色箭形頭所示)，在SO層已經(jīng)可以觀察到GFAP標記陽性的星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)。與Nestin類似，在E10-E16的SGC層(圖1T-W)也可觀察到GFAP陽性的神經(jīng)元(白色箭形所示)。

2.2 雞胚胎視頂蓋不同發(fā)育時期膠質(zhì)細胞的形態(tài)學觀察 由于免疫熒光方法標記的RGCs并不十分清晰，所以E4.5時，神經(jīng)元增殖高峰的時期采用活體原位電轉(zhuǎn)的方法將GFP轉(zhuǎn)入視頂蓋中，GFP標記的細胞包括神經(jīng)元、RGCs和前體細胞(Precursor cells)等。在E8、E10和E12三個時期分別取材(圖2A-C)。RGCs的胞體位于VZ(白色星號所示)，有極性，呈apical-basal雙極突起形態(tài)，每一個RGC都有基足(Basal foot)(白色箭形頭所示)錨定在VZ底部，從胞體的另一端(白色箭形所示)向軟腦膜(Pia)延伸且不分枝的頂突起。胞體位于VZ的位置并不是完全一致，這可能與其處在不同的細胞分裂周期有關(guān)。BLBP標記的RGCs在E12和E14這兩個時間點，在胞體的位置上出現(xiàn)了明顯的變化，故將E14時期的切片放到高倍鏡下觀察。在E14時，分布于視頂蓋各層的大多數(shù)RGCs仍保持雙極神經(jīng)元的特征，但明顯可以觀察到在視頂蓋各層出現(xiàn)了BLBP陽性，但胞體脫離VZ的細胞，這些細胞具有遷移中神經(jīng)元的特征，即有一條長而不分枝的頂突起(Leading process)(白色箭形所示)和卵圓形胞體(Soma)(白色星號所示)(圖2D)。在E18時，GFAP可標記SO層，SAC和SGP層的膠質(zhì)細胞(圖2EF)。SGP層和SAC層的GFAP陽性細胞并沒有明顯的星形膠質(zhì)細胞的特點，胞體位于SAC層或SGP層(白色星號所示)但頂突起明顯變短(白色箭形所示)(圖2E)，免疫熒光染色明顯增強，提示其可能向星形膠質(zhì)細胞方向轉(zhuǎn)化。在SO層，GFAP陽性細胞表現(xiàn)出明顯的星形膠質(zhì)細胞的特點，即胞體(白色星號所示)呈圓形或卵圓形，從胞體發(fā)出許多長而分枝的突起(白色箭形所示，圖2F)。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)由神經(jīng)元(Neuron)和膠質(zhì)細胞(Glial cell)組成。膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的存活、增殖和分化提供營養(yǎng)信號[11，12]。在脊椎動物發(fā)育過程中的膠質(zhì)細胞類型主要為RGCs，而在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后，膠質(zhì)細胞主要包括星形膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞(Oligodendrocyte)和小膠質(zhì)細胞(Microglia)。在這三種膠質(zhì)細胞中，星形膠質(zhì)細胞分布最廣，數(shù)量最多，并認為由RGCs發(fā)育而來。

BLBP的表達具有腦特異性和調(diào)控發(fā)育的特點，由于其存在于細胞胞質(zhì)和胞核中，認為它與成體神經(jīng)發(fā)生和細胞有絲分裂調(diào)控有關(guān)[5]。在禽類視頂蓋中，E3-E8是神經(jīng)元增殖的主要時期，E8-E12是神經(jīng)元進行遷移的主要時期，在E12時視頂蓋可以分為明顯的6層結(jié)構(gòu)，但是SGFS中的10個亞層還沒有完全形成，E14-E18是SGFS中10個亞層形成的主要時期，E18時，視頂蓋層的結(jié)構(gòu)完全形成。BLBP的RGCs染色結(jié)果與視頂蓋神經(jīng)元的層的形成以及神經(jīng)元的遷移過程具有一致性。在E8-E12時，RGCs的胞體主要位于VZ，其突起朝向軟腦膜延伸，終足(Endfoot)終止于軟腦膜。雖然E8-E12是視頂蓋增厚的主要時期，但胞體并沒有離開VZ，仍行使RGCs的主要功能，即作為“腳手架”使新生神經(jīng)元沿著其突起進行遷移。從 E14開始，部分BLBP陽性細胞的胞體離開VZ，隨機分布于視頂蓋的各層，提示其可能沿RGCs進行遷移。而這些陽性細胞可能已經(jīng)開始進行分化，但仍表達BLBP，故可以被BLBP抗體識別。這些胞體離開VZ的BLBP陽性細胞在E14開始出現(xiàn)，E16達到高峰，在E18時又迅速減少。在E14-E18時，大部分神經(jīng)元已經(jīng)遷移結(jié)束，只有形成SGFS層的神經(jīng)元還將繼續(xù)增殖和遷移，所以部分RGCs可能完成其“腳手架”功能，其胞體開始離開VZ，突起變短，開始進行遷移和分化。E18時，視頂蓋層的結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全形成，RGCs明顯減少，且胞體離開VZ層的BLBP陽性細胞的數(shù)量也迅速下降，可能這些細胞已經(jīng)分化為其他細胞。發(fā)育中的RGCs具有神經(jīng)干細胞性質(zhì)，可以作為前體細胞增殖分化出神經(jīng)元，RGCs和星形膠質(zhì)細胞[13]。

E8-E12時是神經(jīng)元進行遷移的主要時期，RC2陽性的RGCs與BLBP陽性的RGCs形態(tài)相同，都是胞體位于VZ，在其胞體上發(fā)出一條朝向軟腦膜的不分枝的突起，終足終止于軟腦膜。而從E14開始，RGCs中RC2的表達明顯減弱，到E18，RC2標記的RGCs已經(jīng)不明顯，提示這可能與大部分神經(jīng)元遷移基本結(jié)束，RGCs開始分化有關(guān)。E14-E18時，RC2標記的RGCs并沒有出現(xiàn)BLBP陽性胞體離開VZ，突起變短的一類細胞，提示RC2與BLBP標記的RGCs可能不是同一亞型或RC2標記RGCs的特異性更強。

Nestin屬于第4類中間絲蛋白(Intermediate filament protein，IFP)，被認為是一種神經(jīng)干細胞(Neural stem cell，NSC)的標記物，并且在進化上高度保守[8]。Nestin表達與 RC2相似，E8-E12表達較強，主要標記RGCs，自E14開始標記RGCs開始減弱，到E18時，表達已不明顯。但不同的是Nestin可標記SGC層的神經(jīng)元，說明該類神經(jīng)元即神經(jīng)節(jié)細胞(Ganglion cell)胞體中可能含有較強的IFP。有研究表明Nestin主要存在于胚胎發(fā)育早期的一些細胞中如放射狀膠質(zhì)細胞、VZ層細胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞前體細胞和神經(jīng)上皮細胞，但并不是所有的神經(jīng)干細胞(Neural stem cell，NSC)都表達 Nestin，特別是一些開始分化的NSC[8]。這也與本試驗結(jié)果一致，即自E14開始RGCs的表達減弱，且Nestin可以標記一些SGC層的神經(jīng)元。

GFAP也是一種 IFP，屬于第3類 IFP[8]。在本試驗的結(jié)果中，在E8-E18的RGCs中均可檢測到GFAP表達，且 E8-E14，RGCs中GFAP表達強度很弱，但在E16和E18明顯觀察出GFAP的表達開始增強，在E18時的SO層中已經(jīng)可以觀察到星形膠質(zhì)細胞，在SAC層和SGP層的細胞突起變短，提示其向星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。GFAP被認為是一種星形膠質(zhì)細胞常見的標記物。GFAP在小鼠發(fā)育中的大腦皮質(zhì)中不能標記RGCs，但可特異性標記星形膠質(zhì)細胞。但有研究發(fā)現(xiàn)在其他脊椎動物如靈長類動物的腦皮質(zhì)RGCS中也檢測到 GFAP的表達[14]。與Nestin相似，在E10-E16的SGC層神經(jīng)節(jié)細胞也被GFAP標記，提示其可能含有IFP。

在E8-E12，隨著大量神經(jīng)元增殖的結(jié)束，VZ層厚度逐漸減小，RGCs的胞體位于VZ，但胞體的位置在VZ層具有apical-basal移動性[15]。有研究表明，RGCs分裂方式為對稱分裂，有細胞分裂相，細胞位于不同的分裂時期(細胞有絲分裂周期:G1-S-G2-M)，胞體在VZ的位置不同，在M期，胞體移動到靠近腦室處;在G1期，胞體開始向軟腦膜移動在S期到達離腦室最遠處;在G2期，胞體又向腦室方向移動，在這一過程中，突起始終與 apical-basal聯(lián)結(jié)[15]。自E14開始，RGCs可能開始向其他類型細胞轉(zhuǎn)化。試驗結(jié)果顯示趨勢是，胞體離開VZ，頂突起明顯變短，有的已經(jīng)具有星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)特點(如E18時 SO層)。

膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元功能的行使起著十分重要的作用，這些作用主要包括對神經(jīng)元的支持、修復、免疫應答、營養(yǎng)和代謝、遷移、發(fā)育和保護等，故膠質(zhì)細胞對于腦的正常發(fā)育、神經(jīng)元調(diào)控和中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的影響十分重要。目前，學術(shù)界廣泛認為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[16]。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，當由于病原體、抗原和毒素等的侵入而導致大腦損傷時，小膠質(zhì)細胞會迅速激活并釋放大量的促炎癥因子，激活免疫系統(tǒng)并吞噬外來病原體和受損細胞[17，18]。小膠質(zhì)細胞除可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞外，在炎癥反應中也起著重要的作用。小膠質(zhì)細胞在細胞內(nèi)毒素LPS刺激下首先激活，周圍的星形膠質(zhì)細胞接受了小膠質(zhì)細胞的免疫信號后被激活，二者配合促進神經(jīng)元的損傷和退化[19]。放射狀膠質(zhì)細胞被認為是一種膠質(zhì)細胞前體，對于研究星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞的發(fā)生和揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應的原理具有重要意義。

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