禽類多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突變體構(gòu)建

李 勁，高 奎，李可可，劉 瀏，劉學(xué)群

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

禽類多瘤病毒(APV)，早期稱鸚鵡幼雛病病毒(BFDV)，能引起多種鸚鵡雛鳥死亡的急性病毒性傳染病，主要感染出殼1～3周的鸚鵡，死亡率高達80%，并感染其他多種鳥禽［1-3］.在禽流感向全世界蔓延不斷有死亡報道和人傳人的可能性不斷增高的情況下，禽類的人禽共患病和病原學(xué)正得到廣泛研究.

對APV-1的晚期基因編碼的前導(dǎo)蛋白Agno-1(1a 和1b)和 Agno-2(2a 和2b)［4-7］的結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn):Agno-1a是一種病毒外殼蛋白VP4［8-9］并與Agno-1b一起導(dǎo)致雞胚成纖維細胞的凋亡，其全基因組線性圖見圖1［10］.APV-1晚期基因多順反子mRNA中下游VP3基因的翻譯以“Leaky Scanning”模式進行，即40S核糖體亞基-翻譯起始復(fù)合物忽視上游VP1的mRNA起始位點并滑到下游VP3的mRNA起始位點，繼而進行VP3蛋白的翻譯.

本文為研究APV-1晚期基因多順反子mRNA下游VP1基因的翻譯調(diào)控機制，設(shè)計含AUG起始碼的編碼7個氨基酸的具有最佳翻譯起始信號的核苷酸插入到agno-1a mRNA的上游(見圖2)，以觀察其對agno-1a mRNA下游VP1翻譯的影響.

圖1 禽類多瘤病毒全基因組線性圖Fig.1 The genome map of Avian polyomavirus

圖2 pHL1003 cDNA質(zhì)粒插入APV-1 agno區(qū)片段示意圖Fig.2 Schematic diagram of pHL1003 cDNA plasmid with inserts of APV-1 agno region

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pHL1003，APV-1的 cDNA質(zhì)粒(見圖3，ango區(qū)域只含agno-1a，除去intron-4而缺失小t基因，德國Giessen大學(xué)Gerd Hobom教授提供)，大腸桿菌DH10b(武

漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)，DNA Marker、ATP、Tag-DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 Acc I、Bam HI、T4-DNA連接酶(Takara公司)，凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.PCR引物(見圖2，上海桑尼生物科技有限公司合成):99-sense(TCCAAATAAGGGAATGCG)，359-Antisense(CGGAGTGCTAAACGGGCTAA);插入片段引物 41(CTACTCCAGCCCGGGATTCCACTATGG)，42(GATGAGGTCGGGCCCTAAGGTGATACC).DNA測序(上海桑尼生物科技有限公司).

1.2 方法

圖3 pHL1003 cDNA質(zhì)粒圖譜Fig.3 The plasmid map of pHL1003 cDNA

1.2.1 pHL1003 的中量制備

［11］，挑?。?0℃超低溫冰箱保存的菌液接種于1mL含amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，220r/min條件下培養(yǎng)12 h，將新鮮培養(yǎng)的1 mL菌液接種于200 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中在37℃，220r/min條件下培養(yǎng)12 h，采取改進的堿裂解法提取DNA，將提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，保存于－20℃冰箱.

1.2.2 酶切質(zhì)粒pHL1003獲取目的片段

冰上操作，用AccⅠ部分酶切，按下列體系加樣:10 × M buffer 20 μL，Acc I 0.5μL，pHL1003 DNA 100μL，ddH2O 79.5 μL，37℃ 酶切 50min.

1.2.3 插入片段41，42 DNA的退火形成和磷酸化處理

將等摩爾濃度的合成引物41，42溶液1︰1混合后加溫至95℃，維持5min后緩慢降至室溫.DNA的磷酸化體系如下:T4 Polynucleotide Kinase 2μL，AIP 2 μL，41，42 DNA 30 μL，10 × T4 polynucleotide kinase buffer 5μL，ddH2O 11μL，37℃水浴12 h，插入片段 41，42 DNA磷酸化后用 3M的 CH3COOK沉淀.

1.2.4 禽類多瘤病毒克隆的構(gòu)建

用T4 DNA連接酶(16℃過夜)連接Acc I酶切回收后的pHL1003大片段和經(jīng)磷酸化處理后的目的插入片段，熱休克法(42℃)轉(zhuǎn)化CaCl2制備的感受態(tài)E.coli DH10b，37℃ LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)1 h后涂布于含Amp的LB平板進行篩選，選擇陽性重組菌落進行質(zhì)粒小量制備.

1.2.5 PCR和PAGE篩選重組質(zhì)粒

以小量制備的重組DNA為模板經(jīng)PCR擴增，檢測是否有片段插入.PCR體系總體積50 μL，含無菌水40.5μL，10 × buffer 5μL，10 μmol/L 正反向引物各 0.25 μL，1 mmol/L dNTP 1.5 μL，0.25 U/μL Tag 聚合酶 1.5 μL，重組 DNA 模板 1 μL.PCR程序:94℃ 5min;94℃ 1min，49℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán);72℃ 10min.8%的 PAGE凝膠檢測，EB染色，凝膠成像儀拍照.對含有插入片段的目的克隆進行DNA測序.

2 結(jié)果與分析

pHL1003 DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳，Acc I部分酶切和陽性克隆的PCR結(jié)果分別見圖4～5.采取堿裂解法中量制備質(zhì)粒DNA，由圖4電泳檢測可見在7.5kb處有2條明顯的條帶，說明提取的DNA效果較好.以此用Acc I部分酶切(見圖5)在約7.5kb處有2條帶，上面的是所需要的目的條帶，下面的是Acc I的2個臨近酶切位點的雙酶切產(chǎn)物.將目的片段回收后與磷酸化處理后的插入片段連接并轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，堿裂解法小量制備后，PCR擴增插入片段兩側(cè)260 bp的DNA片段，經(jīng)8%PAGE檢測(見圖6)，挑選含有插入片段的克?。?2］并測序.

圖4 pHL1003 DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 1%Agarose gelelectrophoresis results of pHL1003 DNA

圖5 pHL1003 DNA的Acc I部分酶切結(jié)果Fig.5 The result of pHL1003 DNA partially digested by Acc I

圖6 陽性克隆的PCR結(jié)果Fig.6 The PCR result of the positive clones

3 測序結(jié)果

APV-1 cDNA克隆及其突變體的agno-1a基因編碼起始區(qū)測序結(jié)果見圖7.由圖7可見，Agno-1a(0)為正常APV-1 cDNA克隆pHL1003，Agno-1a(+1)和Agno-1a(+2)分別為含有1個和2個插入片段的克隆.另外，意外得到Agno-1a(+1')、Agno-1a(+2')、Agno-1a(+2')、Agno1a(+3')、Agno1a(+4')這5個突變克隆，分別含有1個，2個，2個(不同于前者)，3個，4個插入片段的克隆.

4 討論

蛋白質(zhì)翻譯的過程是基因表達的第二階段，其翻譯起始(特別是多順反子的翻譯起始)調(diào)控機制較為復(fù)雜.目前已知的主要有2種多順反子翻譯起始調(diào)控方式:①掃描機制(leaky scanning)依賴于帽子結(jié)構(gòu)的mRNA以CCRCCAUGG作為最佳的翻譯起始密碼子序列.40S核糖體亞基起始復(fù)合物結(jié)合至mRNA帽子結(jié)構(gòu)區(qū)并沿mRNA向下游掃描搜索，借助CCRCCAUGG序列搜尋具較強信號的起始密碼子，以此序列的－3和+4位(斜體帶下劃線字母)決定起始的強度和翻譯效率的高低;②內(nèi)部核糖體進入位點序列 (internal ribosome entry site，IRES)［13］，在小RNA病毒家族中發(fā)現(xiàn)，mRNA無帽子結(jié)構(gòu)，GC含量較高，5'UTR較長，可能存在復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，編碼多種蛋白質(zhì)，存在多個起始密碼子，這些特點令40S核糖體亞基起始復(fù)合物難以通過leaky scanning方式起始翻譯，而以40S核糖體起始復(fù)合物直接結(jié)合于mRNA-AUG區(qū)域的方式起始翻譯.

圖7 APV-1 cDNA克隆及其突變體的agno-1a基因編碼起始區(qū)序列Fig.7 Agno-1a gene coding sequences with ATG of APV-1 cDNA clone and its mutants

禽類多瘤病毒APV-1與其他多瘤病毒基因組的組成和結(jié)構(gòu)類似，分為早期區(qū)、晚期區(qū)及非編碼調(diào)控區(qū).晚期編碼區(qū)可轉(zhuǎn)錄出多種多順反子mRNA，分別翻譯出 Agno-1a、Agno-1b、Agno-2a、Agno-2b、VP1、VP2、VP3.

對APV的晚期基因編碼的前導(dǎo)蛋白Agno-1(1a和1b)和Agno-2(2a和2b)的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究發(fā)現(xiàn)這些Agno蛋白與禽類多瘤病毒的復(fù)制和晚期蛋白的表達有關(guān)［14］.本研究通過在agno-1a基因編碼區(qū)的翻譯起始點插入含AUG起始碼的編碼7個氨基酸的具有最佳翻譯起始信號的核苷酸，成功構(gòu)建了不同的APV-1 cDNA克隆突變體，為在細胞內(nèi)觀察其對agno-1a mRNA下游VP1翻譯的影響，進一步研究禽類多瘤病毒晚期基因的翻譯調(diào)控分子機制打下了良好的基礎(chǔ).

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