章清華 吳深濤 周 祥 閆冬雪 史翠娟 周 靜

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率及患病率逐年升高，胰島β細(xì)胞分泌缺陷和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是糖尿病的重要病理生理基礎(chǔ)。脂聯(lián)素是新近發(fā)現(xiàn)由脂肪組織特異分泌的具有重要功能的一個(gè)細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗，抗炎及抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，在延緩2型糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。前期臨床研究表明化濁解毒法及方藥——化濁解毒顆粒在對(duì)抗糖、脂毒性相關(guān)IR方面療效確切[1]，本研究通過(guò)觀察化濁解毒方藥對(duì)胰島素抵抗大鼠的干預(yù)作用，進(jìn)一步探討其對(duì)脂聯(lián)素及胰島素分泌的影響，明確部分作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及飼料 6周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究所提供。普通飼料由華榮科技有限公司提供，高脂飼料依照文獻(xiàn)[2]配制，即普通飼料中加入20%的脂肪（50%豬油和50%蛋黃粉）和20%蔗糖。

1.2 藥物及試劑 化濁解毒方顆粒（組成：黃連15g、大黃6g、姜黃 15g、僵蠶 6g、蟬蛻 6g、枳實(shí) 20g、清半夏 10g、柴胡15g、白芍 20g、黃芩 15g、干姜 5g、佩蘭 20g），由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥廠制備，批號(hào)101003，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度的溶液。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Prime ScriptRT reagent Kit，perfect Real Time試劑盒與SYBRPremix ExTaqTMⅡ （perfect Real Time）試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成；脂聯(lián)素ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)invitrgeon公司，胰島素放免試劑盒購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取6周齡雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，高脂飼料喂養(yǎng)10周后，按25mg/kg體重的劑量一次性尾靜脈注射STZ（溶于0.1mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.4）。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為：于注射72h后禁食12h，用20%葡萄糖溶液2g/kg灌胃，0和120min血糖分別大于7.0和11.1mmol/L。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為化濁解毒方組、模型組，每組16只。空白對(duì)照組大鼠始終以普通飼料喂養(yǎng)。

2.2 給藥方法 化濁解毒方組予化濁解毒顆粒按生藥3g/（kg·d）灌胃給藥，模型組與空白對(duì)照組灌服生理鹽水，連續(xù)處理8周。

2.3 血清采集及觀察指標(biāo) 各組大鼠在灌胃治療前目?jī)?nèi)眥靜脈叢取血，治療8周后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血。檢測(cè)空腹血糖（FBG）、血漿胰島素（INS）、甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、脂聯(lián)素 （aiponectin，APN）， 計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitive index，ISI）?？崭寡?、甘油三酯及膽固醇采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；血清胰島素采用放免法測(cè)定，其中ISI＝Ln［1/（FBG×FINS）］。

2.4 APN mRNA水平檢測(cè) 提取肝臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以實(shí)時(shí)相對(duì)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)肝臟組織中APN mRNA水平。按SYBRPremix ExTaqTMⅡ試劑盒要求對(duì)APN與GAPDH基因體外擴(kuò)增。APN引物序列為上游引物 ：5′GGAAACTTGTGCAGGTTGGATG 3′；下游引物：5′GGGTCACCCTTAGGACCAAGAA 3′； 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 141bp。內(nèi)參照GAPDH引物序列為上游引物：5′GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3′；下游引物 ：5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA 3′；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 143bp。 每個(gè)樣品APN、GAPDH基因同時(shí)檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)值以（）表示，多組間資料比較用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠經(jīng)處理后血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇變化 治療后，化濁解毒方組大鼠血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇均低于模型組，但均高于空白對(duì)照組；胰島素敏感指數(shù)化濁解毒方組高于模型組，低于空白對(duì)照組；除胰島素敏感指數(shù)外，模型組各指標(biāo)均高于空白對(duì)照組。見表1。

3.2 各組大鼠經(jīng)處理后血清脂聯(lián)素水平 治療后，化濁解毒方組血漿脂聯(lián)素水平高于模型組，但低于空白對(duì)照組，模型組脂聯(lián)素水平遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組，見表2。

3.3 化濁解毒方組與模型組APN mRNA表達(dá)水平的比較治療后化濁解毒方組肝臟組織APN mRNA水平 （相對(duì)拷貝數(shù)）高于模型組，見表3。

4 討論

濁毒是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病的重要因素，并貫穿糖尿病病變之始終[3-5]，對(duì)應(yīng)的化濁解毒法及方藥在前期臨床研究證明其在抗糖、脂毒性相關(guān)IR方面療效確切。該方以古方升降散化裁，清代醫(yī)家楊栗山謂其“蓋取僵蠶、蟬蛻升陽(yáng)中之清陽(yáng)，姜黃、大黃降陰中之濁陰，一升一降，內(nèi)外通和，而雜氣之流毒頓消矣”（《寒溫條辨》卷四）。更以黃連清胃腸之熱，合大黃為君清熱解毒，蕩滌濁邪；加柴胡、黃芩為臣清利少陽(yáng)，瀉肝膽而疏理脾胃；白芍柔肝斂陰，輔佐以不傷陰；枳實(shí)理氣導(dǎo)滯行濁；清半夏降濁合黃連辛開苦降，疏暢中焦；佩蘭和胃化濁消脾癉，干姜辛溫以暖中焦，兩者相合亦制他藥之苦寒。全方共奏化濁解毒、清肝和胃之功。

IR是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，改善IR是預(yù)防和治療2型糖尿病的重要手段。APN是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的脂肪細(xì)胞因子。眾多研究顯示APN是調(diào)控IR的重要因素，也是IR的重要生物標(biāo)記物[6-7]。

本研究結(jié)果表明，化濁解毒方組有效降低了血漿胰島素水平，提高了胰島素敏感性。肝臟是胰島素抵抗的重要靶器官，我們?cè)谘芯恐杏^察了肝臟組織的APN mRNA水平，發(fā)現(xiàn)模型組肝臟組織APN mRNA水平較空白對(duì)照組大為降低，這提示肝臟組織APN mRNA水平和血漿APN水平一樣，都能有效反映機(jī)體的IR水平。經(jīng)過(guò)化濁解毒方治療后，肝臟組織APN mRNA水平較前明顯升高，這提示化濁解毒方改善IR機(jī)制可能與提高肝臟組織APN mRNA水平有關(guān)。我們同時(shí)觀察了模型鼠體內(nèi)脂代謝的狀況，發(fā)現(xiàn)模型鼠血脂譜與正常鼠相比表現(xiàn)出了明顯的紊亂，而經(jīng)過(guò)化濁解毒方治療后，血脂則顯著降低。提示化濁解毒方很可能是通過(guò)提高APN水平而改善脂代謝紊亂。

雖然眾多研究顯示APN是改善IR的重要因素，并作為IR的標(biāo)記物受到重視，但也有人認(rèn)為，APN降低可能是機(jī)體IR導(dǎo)致的結(jié)果，而不是原因[8]。雖然關(guān)于APN與IR的因果關(guān)系尚存爭(zhēng)議，但對(duì)于血漿和肝臟組織APN水平反映IR程度仍是目前的共識(shí)。

表1 各組大鼠血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇水平及ISI（）

表1 各組大鼠血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇水平及ISI（）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01。

表2 各組大鼠血清脂聯(lián)素水平（）

表2 各組大鼠血清脂聯(lián)素水平（）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01。

表3 各組大鼠APN mRNA水平（）

表3 各組大鼠APN mRNA水平（）

注：與模型組比較，**P＜0.01（模型組相對(duì)拷貝數(shù)為 1）；#ΔΔct=（化濁解毒方組目的基因ct值-化濁解毒方組內(nèi)參基因ct值）-（對(duì)照組目的基因ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因 ct值）；▲相對(duì)拷貝數(shù)=2-△△ct。

綜上，化濁解毒方可提高IR大鼠肝臟組織和血漿APN水平，改善大鼠的IR，改善糖、脂代謝紊亂，其具體防治糖尿病作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1]吳深濤，武娜杰，張罡，等.化濁解毒法對(duì)2型糖尿病葡萄糖毒性作用的臨床觀察.天津中醫(yī)藥，2005，22（2）：11

[2]周迎生，高妍，李斌，等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13（3）：154

[3]吳深濤.糖尿病中醫(yī)病機(jī)新識(shí).中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11（11）：808

[4]吳深濤.論濁毒與糖尿病糖毒性和脂毒性的相關(guān)性.中醫(yī)雜志，2004，45（9）：647

[5]吳深濤，閆冬雪.從濁毒論糖尿病血脂異常之防治.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（8）：1047

[6]Stefan N，Stumvoll M，Vozarova B，et al.Plasma adiponectin and endogenous glucose production in humans.Diabetes Care，2003，26（12）：3315

[7]周強(qiáng)，黃漢蓮，周蕓，等.廣州地區(qū)2型糖尿病人群脂聯(lián)素SNP＋45基因型與胰島素抵抗水平的研究.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（2）：316

[8]Cook J R，Semple R K.Hypoadiponectinemia-cause or consequence of human ＂insulin resistance＂.J Clin Endocrinol Metab，2010，95（4）：1544