Smads mRNA在神經(jīng)元樣細(xì)胞氧糖剝奪中的表達(dá)變化

王姣琦，何金婷，李宗樹(shù)，胥桂華，莽 靖，徐忠信

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033）

研究發(fā)現(xiàn)激活素A（ActivinA，ActA）在缺血性腦損傷中發(fā)揮著積極的神經(jīng)保護(hù)作用［1，2］。其介導(dǎo)的ActA／Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要通過(guò)Smads級(jí)聯(lián)反應(yīng)將胞外信號(hào)傳遞入胞內(nèi)［3］。根據(jù)Smads蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的不同作用，可將其分為3類(lèi)：膜受體激活的Smads（receptor－activated Smads，RSmads），包括Smad1，2，3，5和8；通用Smad（common mediator Smads，Co－Smad），目前發(fā)現(xiàn)的僅有Smad 4；抑制性 Smads （inhibitory Smads，ISmads），包括Smad6、7［4］。本研究通過(guò)微管相關(guān)蛋白（Microtubule－associated protein 2，MAP2）染色驗(yàn)證鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF，50ng／ml）誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞的神經(jīng)元特性［5］。繼而構(gòu)建神經(jīng)元樣細(xì)胞氧糖剝奪模型（oxygen－glucose deprivation，OGD），體外模擬腦神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷［6］。利用Real Time RT－PCR技術(shù)對(duì)OGD0，3，6h，Smad2、4、7基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步明確ActA／Smads通路的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）購(gòu)自Sigma公司。兔抗大鼠 MAP2一抗、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司。Smad2、4、7及內(nèi)參GAPDH基因引物委托上海生工公司合成。UNIQ－10柱式Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%馬血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)液2－3天更換一次，細(xì)胞接近80%融合時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元及鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以2.5－5×104·孔－1接種于預(yù)先放有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1－2天，細(xì)胞貼壁后加入NGF（終濃度50ng／ml），5天后取出細(xì)胞爬片，經(jīng)0.01MPBS浸洗、0.1%TRiton X－100通透、羊血清封閉后加入 MAP2一抗（1∶500）4℃濕盒中過(guò)夜孵育，0.01MPBS浸洗后FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗37℃作用20min，防淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 神經(jīng)元樣細(xì)胞OGD模型的建立 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞，用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液沖洗3次，再用含10%胎牛血清和1.0mmol／L Na2S2O4的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶放入37℃孵箱內(nèi)的缺氧罐中，計(jì)時(shí)0、3、6h分別建立OGD0，3和6h組。

1.2.4 Real Time RT－PCR檢測(cè)Smads基因 mRNA的表達(dá)變化 收集上述3組細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。應(yīng)用Real Time RT－PCR方法檢測(cè)Smad2、4、7等基因 mRNA的表達(dá)，基因檢測(cè)引物如下：Smad2F：5′－TCA GTG CGA TGC TCA AGC ATG TCC－3′，R：5′－AGA CCA AGC AGC AGC ACA CAC CTC－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度413bp；Smad7F：5′－TCC TGC TGT GCA AAG TGT TC－3′，R：5′－AGT AAG GAG GAG GGG GAG AC－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度104bp；Smad4F：5′－TCA CCG GCA GAT GCA GCA GC－3′，R：5′－GGC CCC AGC CCT TCA CGA AG－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度 203bp；GAPDH F：5′－GGT TAC CAG GGC TGC CTT CT－3′，R：5′－ATG GGT TTC CCG TTG ATG AC－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度171bp。反應(yīng)體系為10μl，含上／下游引物（10nmol／L）各1μl，模板 DNA 2μl（約20 ng），ddH2O 1μl，Real Master Mix 5μl。應(yīng) 用ABI7500Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，ABI7500Fast程序軟件進(jìn)行熒光收集和資料分析。設(shè)定PCR運(yùn)行參數(shù)為95℃預(yù)變性3min，然后95℃變性5s，60℃退火與延伸25s，共40個(gè)循環(huán)，并設(shè)定融解曲線程序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Relative Quantification（ddCt）Study進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量（relative quantity，RQ）RQ分析。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照，計(jì)算各基因在各組細(xì)胞之間的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS l0.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料用±s描述，兩個(gè)樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析法，兩組間比較用Students t－test，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 MAP2免疫熒光染色

正常PC12細(xì)胞為圓形，易聚集成團(tuán)，呈半懸浮狀態(tài)。經(jīng)NGF誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞散在分布、呈星形并帶有較長(zhǎng)突起。MAP2染色后，藍(lán)色激發(fā)光下胞體呈現(xiàn)綠色熒光；紫色激發(fā)光下可見(jiàn)呈藍(lán)色熒光的復(fù)染細(xì)胞核。說(shuō)明NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞MAP2強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

2.2 Smad2mRNA的表達(dá)變化

OGD3h后Smad2基因mRNA的表達(dá)較OGD0h組升高17.7%；OGD6h，Smad2mRNA 的表達(dá)較OGD0h組下調(diào)80.9%，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊＊P＜0.05，圖1－A）。說(shuō)明氧糖剝奪可早期激活A(yù)ctA／Smads通路在神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.3 Smad4mRNA的表達(dá)變化

OGD處理3h，神經(jīng)元樣細(xì)胞Smad4mRNA的表達(dá)與OGD0h組相比明顯升高，超過(guò)413.4%；OGD6h組Smad4mRNA的表達(dá)與OGD3h相比下調(diào)73.0%，但與OGD0h相比，表達(dá)提高38.8%，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊＊P＜0.05，圖1－B）。

2.4 Smad7mRNA的表達(dá)變化

經(jīng)OGD處理3h后Smad7mRNA的表達(dá)水平與OGD0h相比明顯升高，超過(guò)75.2%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊＊P＜0.05）。延長(zhǎng) OGD時(shí)間至6h，Smad7mRNA的表達(dá)較OGD0h組下降57.4%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊＊P＜0.05，圖1－C）。

圖1 Smad2，4，7基因mRNA表達(dá)的相對(duì)定量

3 討論

最近的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor－beta，TGF－β）超家族的重要成員ActA，在腦組織的缺血缺氧性損傷中發(fā)揮著積極的神經(jīng)保護(hù)功能［7］。激活的ActA首先與TGF－βII型受體（TGF－βreceptor II，TβRII）結(jié)合，激活TβRII磷酸化激酶的同時(shí)形成受體復(fù)合物，TGF－βI型受體（TGF－βreceptor I，TβRI）結(jié)合該復(fù)合物，磷酸化激活后完成對(duì)Smad2／3的磷酸化活化，從而實(shí)現(xiàn)胞外信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］。作為ActA通路細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)的主要蛋白，Smads根據(jù)其功能的不同又分為3類(lèi)，即 R－Smads，Co－Smad和I－Smads。作為T(mén)GF－β或ActA的下游受體，Smad2／3通過(guò)與TβRI型受體作用而磷酸化激活。磷酸化的Smad2／3與Smads錨著蛋白（Smad anchor for receptor activation，SARA）分離并與Smad4形成 Smad2／4 和Smad3／4復(fù)合物，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用完成對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控［9］。I－Smads通過(guò)促進(jìn) TβRI受體降解，或與 RSmads競(jìng)爭(zhēng)TβRI結(jié)合位點(diǎn)，抑制R－Smads磷酸化水平的方式來(lái)發(fā)揮其對(duì)該通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。

本研究通過(guò)構(gòu)建神經(jīng)元樣細(xì)胞氧糖剝奪模型，體外模擬神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷。利用Real Time RT－PCR技術(shù)對(duì)OGD 0，3或6h，Smad2、4、7基因mRNA的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD處理3h后神經(jīng)元樣細(xì)胞Smad2基因mRNA的表達(dá)與未處理組相比明顯升高，分別超過(guò)17.7%。這進(jìn)一步證明了氧糖剝奪模擬的神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷中，ActA／Smads通路可以在OGD早期即通過(guò)提高通路上關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)來(lái)激活。而延長(zhǎng)OGD時(shí)間至6h，Smad2基因mRNA的表達(dá)較未處理組下調(diào)80.9%。說(shuō)明 ActA／Smads通路應(yīng)對(duì)OGD損傷時(shí)轉(zhuǎn)錄水平上的激活僅存在于OGD的早期，隨著OGD時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷加重，ActA／Smads通路轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)也下調(diào)，甚至低于基礎(chǔ)水平。Smad4mRNA的表達(dá)變化也證實(shí)了這一推測(cè)。OGD3h時(shí)，Smad4mRNA表達(dá)明顯升高，與OGD0h相比上調(diào)413.4%。OGD6h時(shí)Smad4mRNA的表達(dá)水平較OGD3h組下調(diào)73.0%，與OGD0h相比，表達(dá)仍提高38.8%。這可能與OGD3h時(shí)Smad4mRNA表達(dá)過(guò)高有關(guān)。抑制性Smads，Smad7mRNA在OGD3h時(shí)的表達(dá)水平較 OGD0h升高75.2%；OGD6h時(shí)表達(dá)下降57.4%。說(shuō)明ActA／Smads通路在轉(zhuǎn)錄水平上激活的同時(shí)，也存在著Smad7轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)性調(diào)節(jié)功能的增強(qiáng)，兩者動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)完成對(duì)通路活化程度的調(diào)控。Hasan O.等人的研究也發(fā)現(xiàn)缺氧性損傷可提高血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Smads基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)［10］。說(shuō)明Smads介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制不僅存在于神經(jīng)元，而且還包括血管內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，ActA／Smads通路激活主要發(fā)生在神經(jīng)元樣細(xì)胞OGD損傷的早期（OGD3h），Smad2，4基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)上調(diào)是該通路活化的重要組成部分。抑制性Smad7轉(zhuǎn)錄水平上參與該通路的負(fù)性調(diào)節(jié)過(guò)程。上述研究提示我們對(duì)ActA／Smads通路神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究，可能為神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷后的神經(jīng)保護(hù)提供新思路。

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