CD8＋T淋巴細(xì)胞在動脈粥樣硬化斑塊中作用的研究

馮 靜，孟曉萍

（1.北京市門頭溝區(qū)醫(yī)院 心內(nèi)科，北京102300；2.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 心內(nèi)科，吉林 長春130033）

1 材料與方法

1.1 主要試劑與所需實驗材料的配制

鼠抗人CD8抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。SP－9710試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。高脂飲食配制：按照重量比：10%豬油，1%膽固醇，5%蛋黃粉，0.1%脫氧膽酸，84%基礎(chǔ)飼料。

1.2 試驗動物及模型建立

實驗動物購買自北京維通利華實驗動物公司，共28只，8周齡，雌雄不限。其中16只為Apoe基因敲除 （Apoe－／－）小鼠，平均體重22g，隨機分為高脂飲食組（以后簡寫為Ah）10只，正常飲食組（An）6只；另12只為與基因敲除小鼠同源的C57BL／6小鼠，平均體重17g，隨機分為高脂飲食組（Ch）6只，正常飲食對照組（Cn）6只。Ah組及Ch組小鼠給予高脂飲食，An組及Cn組給予正常飲食，喂養(yǎng)12周。

1.3 標(biāo)本制備

造模12周后，脫頸處死小鼠，快速分離主動脈（由主動脈弓至髂動脈分叉），留取主動脈弓，置于4%多聚甲醛中固定約48小時，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作，獲得石蠟包埋標(biāo)本。

1.4 HE染色

將小鼠主動脈弓部石蠟包埋標(biāo)本切片組織立即泡于10%福爾馬林固定液中固定24h，予以常規(guī)石蠟包埋、切片，制成4μm切片；行HE染色。

染色結(jié)果：胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，紅細(xì)胞呈桔紅色，其他成分呈深淺不同紅色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行血管形態(tài)學(xué)觀察及拍照。

1.5 免疫組織化學(xué)染色及圖像分析

1.5.1 取得臨床標(biāo)本組織立即泡于10%福爾馬林固定液中固定24h，予以常規(guī)石蠟包埋、切片；再將切片貼附于涂有多聚賴氨酸的玻片上備用，待行免疫組化染色。CD8抗體檢測采用免疫組化S－P法（鏈霉素抗生物素蛋白一過氧化物酶），按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 圖像分析 在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。采用單盲法閱片，每張切片隨機取4個視野，應(yīng)用計算機圖像分析，采用Motic Images Advanced3.2圖像分析儀測灰度值（灰度值越大陽性越弱）測定抗CD8免疫沉淀物灰度值對染色程度作相對定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動脈斑塊活體觀察結(jié)果

Ah組小鼠有動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊主要集中在動脈分叉處，斑塊數(shù)量中等，腹主動脈某些小鼠可見斑塊。An組小鼠無動脈粥樣硬化斑塊形成。Ch組小鼠未見動脈斑塊形成，但腹腔及各組織臟器表面脂肪含量明顯增多。對照組（Cn）小鼠無動脈斑塊形成。

2.2 小鼠主動脈HE染色結(jié)果

Ah組小鼠HE表現(xiàn)為內(nèi)膜凸向于官腔形成大的斑塊，內(nèi)彈性膜被破壞，并可見大量泡沫細(xì)胞。Ch組小鼠HE染色可見小的斑塊，內(nèi)彈性膜粉染部分被破壞。An組及Cn組小鼠HE均表現(xiàn)為正常的血管結(jié)構(gòu)，4組小鼠外膜皆為結(jié)締組織。

圖2 An組HE染色

圖3 Ch組HE染色

圖4 Cn組HE染色

圖1－4均為鏡下100倍成像：①Ah組小鼠HE表現(xiàn)為內(nèi)膜凸向于官腔形成大的斑塊，內(nèi)彈性膜被破壞，內(nèi)膜可見大量泡沫細(xì)胞，中膜被破壞有大量的膽固醇結(jié)晶。②An組小鼠HE表現(xiàn)為正常的血管結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜光滑內(nèi)皮細(xì)胞胞核略凸向于官腔，內(nèi)彈性膜粉染清晰可見；中膜由幾層平滑肌細(xì)胞組成。③Ch組小鼠HE表現(xiàn)為內(nèi)膜略凸向于官腔，可見小的斑塊，內(nèi)彈性膜粉染部分被破壞；中膜由幾層平滑肌細(xì)胞組成，斑塊處平滑肌細(xì)胞排列紊亂。④Cn組小鼠HE表現(xiàn)為正常的血管結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜光滑內(nèi)皮細(xì)胞胞核略凸向于官腔，內(nèi)彈性膜粉染清晰可見；中膜由幾層平滑肌細(xì)胞組成，平滑肌細(xì)胞核為長桿狀。

2.3 抗CD8免疫組化染色結(jié)果

Ah組小鼠表達(dá)很少量的黃褐色顆粒，該顆粒表示為被辣根過氧化酶標(biāo)記的CD8；An組可見較多的黃褐色顆粒；Ch組，表達(dá)少量的黃褐色顆粒；Cn組黃褐色顆粒表達(dá)較多，呈強陽性；見圖5～8（均為鏡下200倍成像）。

圖5 Ah組抗CD8免疫組化染色

圖6 An組抗CD8免疫組化染色

圖7 Ch組抗CD8免疫組化染色

圖8 Cn組抗CD8免疫組化染色

2.4 抗CD8灰度值比較

An組，Ch，組Ah組各自抗CD8灰度值較Cn組均升高，且P＜0.01；組間CD8灰度值比Ah＞Ch＞An＞Cn，即表達(dá)CD8水平為Ah＜Ch＜An＜Cn，見表1。

表1 CD8免疫沉淀物灰度值分析（±s）

表1 CD8免疫沉淀物灰度值分析（±s）

與對照組（Cn）比較＊＊P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義.

組別 n CD8 P值0.01 Cn 6 71.3±1.212 An 6 103.83±5.193＊＊ ＜0.01 Ch 6 125.0±2.608＊＊ ＜0.01 Ah 10 134.7±2.497＊＊ ＜

3 討論

近年來，免疫機制在動脈粥樣硬化（atherosclerotic，AS）形成中的作用備受觀注，多種細(xì)胞及細(xì)胞因子相互作用、影響，共同形成AS的免疫機制，促成了AS的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明[1，2]，在AS斑塊的進(jìn)展過程中，T淋巴細(xì)胞在AS斑塊內(nèi)占所有有核細(xì)胞總數(shù)的10%－20%，然而T淋巴細(xì)胞在AS中究竟扮演何種角色，目前尚無定論。關(guān)于CD8＋T淋巴細(xì)胞在AS中的作用及其在AS中的表達(dá)水平亦有爭論，Hsue等發(fā)現(xiàn)[3]耗竭C57BL／6小鼠體內(nèi)CD4＋和CD8＋T淋巴細(xì)胞可以減少脂紋的形成；國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在CHD患者中，CD4＋T淋巴及CD8＋T淋巴兩個亞群細(xì)胞的比例都有減少，其中以CD8細(xì)胞減低更為顯著，T淋巴細(xì)胞功能出現(xiàn)異常[4]。

本實驗結(jié)果顯示：在AS過程中，CD8＋T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。我們認(rèn)為無論是CD8＋T淋巴細(xì)胞減少還是增多都說明在AS過程中伴隨著免疫反應(yīng)。這種反應(yīng)可能加重動脈粥樣硬化，尤其是在ApoE基因敲除小鼠，因為高脂喂養(yǎng)可使ApoE基因敲除小鼠迅速形成廣泛且典型的AS斑塊，隨時間進(jìn)展，斑塊體積逐漸增加，鈣化逐漸加重。我們認(rèn)為：CD8＋T淋巴細(xì)胞可能引起與AS相關(guān)的普遍的細(xì)胞凋亡[5]和細(xì)胞裂解機制，進(jìn)而促成AS形成。而到目前為止，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道，其可能的機制是[6－8]：①CD8＋T細(xì)胞特異性識別靶細(xì)胞表面的抗原肽途徑：MHC分子復(fù)合物后，通過顆粒胞吐釋放穿孔素，使靶細(xì)胞膜出現(xiàn)大量小孔，因膜內(nèi)外滲透壓不同，水分則進(jìn)入胞漿，靶細(xì)胞脹裂而死導(dǎo)致細(xì)胞裂解，細(xì)胞調(diào)亡。②粒酶途徑。CD8＋T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體與靶細(xì)胞表面呈遞的抗原互相作用，形成聚合體。細(xì)胞中的高爾基體開始堆積，含有粒酶（granzymes）的顆粒重新定位于與靶細(xì)胞相接觸的區(qū)域，并通過胞吐作用（exocytosis）釋放穿孔素（perforin）和粒酶，后者在前者的幫助下進(jìn)入靶細(xì)胞，激活細(xì)胞的凋亡（apoptosis）路徑，誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。③Fas途徑，某些CD8＋T細(xì)胞缺乏穿孔素和粒酶，它們通過Fas途徑來介導(dǎo)細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。另外，CD8＋T細(xì)胞活化后能夠分泌出大量的炎癥因子，包括細(xì)胞因子、趨化因子等，如白細(xì)胞介素、IFN－r、TNF－a、TNF－β等，這些因子可激活巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞再釋放出多種細(xì)胞因子，起到免疫級聯(lián)擴(kuò)大的效應(yīng)，使動脈成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)程。細(xì)胞凋亡也可能由巨噬細(xì)胞和平滑肌在致炎細(xì)胞因子的作用下產(chǎn)生的活性氧和含氮類活性成分引起。

我們的實驗是應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型，而在ApoE基因敲除小鼠的高脂飲食組動脈粥樣硬化的斑塊部位CD8＋T淋巴細(xì)胞表達(dá)減少，說明在疾病發(fā)生發(fā)展過程中除了細(xì)胞免疫的參與，還可出能出現(xiàn)錯綜復(fù)雜的相互協(xié)同、相互影響的抗原抗體反應(yīng)，促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展。目前認(rèn)為可能與AS發(fā)病相關(guān)的抗原有氧化的低密度脂蛋白（OX－LDL），OX－LDL在 AS的發(fā)生發(fā)展中起多方面的作用，其一是作為抗原引發(fā)AS的免疫反應(yīng)[9]。AS斑塊部位的CD8＋T細(xì)胞可對OX－LDL產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子、機械損傷、炎性反應(yīng)、ox－LDL、氧自由基、T淋巴細(xì)胞均能調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生[10]?；罨腃D8＋T淋巴細(xì)胞可分泌出大量的TNF－a，后者表達(dá)的升高，可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌的膠原酶增多及MMPs量的改變[11]，參與 AS的形成。

目前許多免疫性疾病通過免疫抑制治療都取得了較好的療效，把免疫機制作為AS研究的切入點，進(jìn)一步研究T淋巴細(xì)胞在AS中作用機制，可以為AS的診斷和治療提供新的方向。

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