利用自體富血小板血漿構(gòu)建凝膠生物細(xì)胞支架的實驗研究

劉 偉，陳 劍，宋 佳，宋滇文＊

（1.解放軍第113醫(yī)院 骨科，浙江 寧波315040；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 骨科，杭州310016；

3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院 骨科，上海200003）

富血小板血漿（Platelet－rich plasma，PRP）是從自體血中提取出來的血小板濃縮物，來源于自體，無免疫排斥反應(yīng)，制作方便，對機(jī)體創(chuàng)傷小。大量臨床研究報道，PRP能促進(jìn)骨和軟組織的修復(fù)，近年來，PRP已經(jīng)被應(yīng)用于骨科，頜面外科，神經(jīng)外科等多種學(xué)科。富血小板血漿凝膠（Platelet－rich plasma gel，PRG）是PRP被凝血酶等激活物激活后形成的膠凍狀物，含有大量的各種血小板源性細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)多種組織修復(fù)的作用，PRG作為一種新的骨修復(fù)材料，其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。PRG本身還呈現(xiàn)典型的多孔性結(jié)構(gòu)[1]，并具有良好的粘附性，符合骨組織工程支架材料的要求，本實驗即研究PRG生物細(xì)胞支架的三維空間結(jié)構(gòu)以及與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）共培養(yǎng)后的組織相容性，以為下一步構(gòu)建組織工程骨奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 富血小板血漿激活劑的配制，取5 g 10%氯化鈣（Amersco）溶于50ml去離子水，0.2 μm濾膜過濾后分裝，－20℃保存。臨用時在0.5 ml 10%氯化鈣溶液中加入凝血酶500U（如吉生物）。

1.2 Lendersberg法制備PRP 取成年新西蘭大白兔，從其耳緣靜脈抽取靜脈血10ml，加入2ml 0.109M檸檬酸鈉抗凝；將抽取靜脈血200g離心10min；吸取全部上清液直至交界面下3mm，并將其移至另一離心管；平衡后200g離心10min；離心管中液體分為2層，吸取3／4上清液棄掉，剩余即為PRP，再取20μL PRP進(jìn)行血小板計數(shù)；同時取20 μl全血作為對照。此步重復(fù)三次。

1.3 血小板計數(shù)方法 于清潔試管中加入稀釋液0.38ml。準(zhǔn)確吸取待測標(biāo)本20μl，擦去管尖外附著血液，置于血小板稀釋液內(nèi)，立即充分混勻。待完全溶血后再次混勻1min。取上述均勻的血小板懸液1滴，注入計數(shù)池內(nèi)，靜置10－15min，使血小板下沉。按以下公式計算：血小板數(shù)／L＝5個中方格內(nèi)血小板數(shù)×5×10×20×106／L。

1.4 PRG生物細(xì)胞支架的構(gòu)建 用2ml注射器依次吸入0.8ml PRP、0.2ml激活劑及少許空氣，搖勻，靜置5－10min，即制成PRG生物支架，并進(jìn)行大體標(biāo)本和掃描電鏡（日立S－520）觀察。

1.5 兔BMSCs在PRG生物細(xì)胞支架中的生長將通過全骨髓貼壁法培養(yǎng)獲得的第3代兔BMSCs以0.05%胰酶／0.02%EDTA消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為106左右，制成兔BMSCs細(xì)胞懸液；將前步制備的PRP和BMSCs細(xì)胞懸液以4∶1的比例混合；將PRP和BMSCs混合物500μl移入15ml離心管，混合均勻后加入80μl激活劑；待PRP形成凝膠后，加入2%FBS的DMEM－LG培養(yǎng)基2ml左右，隔日換液，培養(yǎng)1周后停止培養(yǎng)，并將部分標(biāo)本取出后剪碎，以胰酶消化后再置于10%FBS的DMEMLG培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)以及增殖能力。同時將培養(yǎng)至第3天的部分標(biāo)本固定后行掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 PRP的制備 通過Lendersberg兩步離心法順利制得富血小板血漿（PRP），方法簡便快速，容易制備。

2.2 血小板計數(shù) 全血中血小板濃度三次測定結(jié)果分別為340×109／L、378×109／L和336×109／L（平均351×109／L），PRP中血小板濃度三次測定結(jié)果分別為1290×109／L、1321×109／L和1330×109／L（平均1314×109／L），與全血相比，PRP中的血小板濃度增加了3.74倍。

2.3 PRG生物支架大體標(biāo)本和掃描電鏡結(jié)構(gòu)PRP經(jīng)過激活劑激活后5－10min就形成膠凍狀的PRG。掃描電鏡掃描結(jié)果顯示其凝膠三維結(jié)構(gòu)中，主要框架結(jié)構(gòu)為纖維素，纖維素之間縱橫交錯并形成復(fù)雜的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙直徑約50－100微米，其中附著有大量的血小板細(xì)胞和少量的紅細(xì)胞（圖1）。

圖1 掃描電鏡下PRG的三維結(jié)構(gòu)圖?？紫吨睆郊s50－100微米，附著有大量的血小板和少量紅細(xì)胞。

2.4 兔BMSCs在PRG中的生長 兔BMSCs在PRG中培養(yǎng)3天，行掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示：在PRG三維結(jié)構(gòu)中，兔BMSCs在纖維素支架構(gòu)成的纖維網(wǎng)絡(luò)中附著良好（圖2）。培養(yǎng)1周后將兔BMSCs和PRG構(gòu)成的復(fù)合物消化后再于10%FBS的DMEM－LG中培養(yǎng)，1d后見培養(yǎng)皿底可見有梭形以及多角形細(xì)胞貼壁，1周后細(xì)胞生長良好并繼續(xù)增殖（圖3），證明兔BMSCs可以在PRG中存活和生長。

圖2 兔BMSCs附著于PRG三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。

圖3 兔BMSCs和PRG共培養(yǎng)1周并消化后再培養(yǎng)：A，1d后見培養(yǎng)皿底可見有梭形以及多角形細(xì)胞貼壁；B，1周后細(xì)胞生長良好并繼續(xù)增殖。

3 討論

PRP的制作方法主要有血漿分離法、一次離心和兩次離心技術(shù)。血漿分離法需要專業(yè)的血漿分離機(jī)，費(fèi)用昂貴，過程復(fù)雜，難以普及。一次離心法制備PRP對血液只經(jīng)過一次離心，血小板回收率低，難以得到高濃度PRP，激活后亦不能分泌足量細(xì)胞生長因子。兩次離心法是目前獲取PRP的主要途徑，即對抽取的血液經(jīng)過兩次離心，有較高的血小板回收率，可獲取高濃度PRP。

大多數(shù)研究證實了PRP具有促進(jìn)骨修復(fù)的作用[2，3]，因此PRP目前被越來越多的應(yīng)用到骨修復(fù)和骨組織工程中。PRP促進(jìn)骨缺損修復(fù)可能主要基于以下兩種機(jī)制：一種為PRP在激活劑作用下活化為PRG，其中含有大量纖維蛋白原，能封閉創(chuàng)面，促進(jìn)組織收縮和愈合；另一種為聚合過程中血小板收縮、脫顆粒釋放多種高濃度生長因子，包括PDGF、TGFβ、VEGF、IGF和 EGF等，這些生長因子在骨與軟組織的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，可以加速細(xì)胞分化[4]，促進(jìn)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖[5]。這些細(xì)胞因子中中最重要的是為PDGF和TGFβ，PDGF可以促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和微血管形成，同時還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性[6]，TGF－β則可促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖并抑制骨吸收[7，8]，PRG中其他生長因子也同時具有良好的促進(jìn)骨與軟骨修復(fù)和再生的作用[9]。Yamada等[10]研究認(rèn)為PRP和間充質(zhì)干細(xì)胞混合物注射到骨缺損部位后，其骨修復(fù)作用與自體松質(zhì)骨顆粒移植效果相當(dāng)。當(dāng)然，PRP需來源于自體，并具有一定的濃度才能達(dá)到預(yù)期效果，若采用異體血制備得到的PRP，則會因為免疫反應(yīng)而得到陰性結(jié)果[11]。同時，已有大量研究結(jié)果證實PRP應(yīng)用于骨組織工程時，其釋放的多種生長因子亦具有明確的促進(jìn)BMSCs增殖的作用[12]，因此其應(yīng)用于組織工程具有其他支架材料無法具備的獨(dú)特優(yōu)點。

PRG在組織工程中的應(yīng)用不僅作為細(xì)胞生長和分化的誘導(dǎo)因子，其具有特殊的三維空隙結(jié)構(gòu)，孔隙直徑從10μm[1]至200－1000μm[13]不等，孔隙率約80%左右，符合骨組織工程支架材料的要求。目前以PRG作為細(xì)胞支架的組織工程研究還十分有限，Del Bue等[14]將其作為支架材料用在馬肌腱的組織工程重建，結(jié)果顯示87.5%取得了良好效果。Drengk等[15]研究顯示PRG作為細(xì)胞支架能明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的增生和向軟骨細(xì)胞分化。本實驗制備的自體PRG生物細(xì)胞支架孔隙直徑約50－100微米，具有完整的三維結(jié)構(gòu)和良好的組織相容性，與兔BMSCs復(fù)合培養(yǎng)后種子細(xì)胞與纖維素附著良好，血小板顆粒分布均勻，經(jīng)體外培養(yǎng)后消化再培養(yǎng)仍有大量細(xì)胞生長，說明PRP與種子細(xì)胞有良好的生物相容性，與其他細(xì)胞支架相比具有諸多優(yōu)點：（1）PRG生物支架材料有良好的孔隙率，本身具有豐富的細(xì)胞生長因子如 TGF－β、PDGF、IGF等，能明顯促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，這是其它支架材料所沒有的；（2）富PRP和自體BMSCs均來源于自體，無免疫源性；（3）與其他支架材料相比，PRG生物細(xì)胞支架材料不需要將支架與細(xì)胞在體外培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程骨時已與干細(xì)胞充分混勻，避免了細(xì)胞只附著于支架材料表面或長入支架材料不充分的缺點；（4）對組織損傷小，費(fèi)用低，易于應(yīng)用和推廣；（5）將種子細(xì)胞復(fù)合PRG生物細(xì)胞支架構(gòu)建的組織工程材料可經(jīng)皮體外注入，操作方便。本實驗結(jié)果表明自體富血小板血漿凝膠是一種優(yōu)良的組織工程細(xì)胞支架，具有良好的應(yīng)用前景。

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