Wortmannin對糖尿病腎病大鼠腎組織TNF－α與VEGF表達(dá)的影響

關(guān)瑩瑩，曹東華

（中國人民解放軍第二○二醫(yī)院 檢驗科，遼寧 沈陽110003）

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）／絲氨酸一蘇氨酸激酶 （v－akt murine thymoma viral oncogene homolog，Akt）通路是真核細(xì)胞關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞凋亡、代謝、增殖及分化等生命活動中發(fā)揮著重要功能，近年來發(fā)現(xiàn)PI3K／Akt信號通路與糖尿病腎病（DN）的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠模型的腎皮質(zhì)中PI3K及Akt活性升高[1]，大鼠糖尿病發(fā)病4周后整個腎臟的磷酸化PKB／Akt水平增加，并且體內(nèi)由Gas6腎臟因子介導(dǎo)的腎小球肥大與PI3K／Akt信號通路有關(guān)[2]，雷帕霉素可以緩解大鼠的DN，也能減低腎小球內(nèi)活化的mTOR及Akt的升高[3]。但是PI3K／Akt信號通路在DN發(fā)病機(jī)制中具體是如何發(fā)揮作用的尚不清楚。本研究利用Western blot方法和RT－PCR方法，檢測DN大鼠在注射PI3K抑制劑Wortmannin后腎組織TNF－α與VEGF表達(dá)的變化，為進(jìn)一步闡明PI3K／Akt信號通路在DN發(fā)病中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊抗大鼠TNF－α與VEGF多克隆抗體（Santa－Cruz）；PI3K阻斷劑（Wortmannin）購自Santa Cruz公司，STZ購自美國Sigma公司。

1.2 動物模型的建立及分組

成年健康清潔級SD大鼠40只，雄性，體重200－225g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物部提供。其中30只大鼠用于復(fù)制DN模型，10只大鼠作為假手術(shù)組。參照Anderson等[4]的方法復(fù)制DN模型，10%水合氯醛麻醉（0.3ml／100g），常規(guī)備皮消毒，腹部切口，暴露右腎，切除，滴加慶大霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組僅暴露右側(cè)腎臟，并不進(jìn)行切除手術(shù)。2W后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），50 mg／kg，假手術(shù)組大鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。實(shí)驗期間動物自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。48h后尾尖取血，測定血糖，血糖≥16.7mmol／L為造模成功。選取20只模型成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組與Wortmannin處理組。糖尿病模型建立次日起，Wortmannin處理組靜脈注射 Wortmannin（0.5mg／kg），1次／周，共8W，實(shí)驗期間動物自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島索及其他降糖藥物，模型組與假手術(shù)組注射等量生理鹽水。

1.3 Western blot方法檢測腎組織TNF－α與VEGF的表達(dá)

第8周最后1次給藥后，禁食8h，麻醉處死，冰上取左腎皮質(zhì)，超聲粉碎，離心取上清，Bradford法測定蛋白濃度，加入樣品緩沖液，沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，12%分離膠，4%濃縮膠，電泳，轉(zhuǎn)印，4℃過夜。一抗 TNF－α、VEGF 與β－actin （1∶200）室溫孵育2h，洗膜，IgG－HRP（1∶5000）室溫孵育2h，ECL發(fā)光，凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測目標(biāo)帶的平均光密度（MOD）。

1.4 RT－PCR法檢測腎組織TNF－α mRNA 與VEGFmRNA的表達(dá)

麻醉處死大鼠，冰上取左腎皮質(zhì)，標(biāo)本量80－100mg，按RNAout說明書進(jìn)行總mRNA提取，然后以逆轉(zhuǎn)錄（RT法）先合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增；TNF－α：上 游 為 5′－CGAGTGACAAGCCCGTAGCC－3′； 下 游 為 5′－GGATGAACACGCCAGTCGCC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長255bp。VEGF：上游為5′－ACTGGACCCTGGCTTTACTGC－3′；下游為5′－TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長310bp；β－－actin：上游為5′－GAGACCTTCAACACCCAGCC－3′；下游為：5′－GCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長374bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，模型組與Wortmannin處理組腎組織TNF－α與VEGF蛋白的表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），而與模型組相比，Wortmannin處理組腎組織TNF－α與VEGF蛋白的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。見圖1，圖2。

圖1 Western blot方法檢測各組小鼠TNF－α和VEGF蛋白的表達(dá)

圖2 各組小鼠TNF－α和VEGF蛋白的光密度值比較

2.2 RT－PCR 結(jié)果

RT－PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組與Wortmannin處理組腎組織TNF－αmRNA與VEGFmRNA的表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），而 Wortmannin處理組腎組織TNF－αmRNA與VEGFmRNA的表達(dá)則明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖3，圖4。

圖3 RT－PCR方法檢測各組小鼠TNF－αmRNA和VEGFmRNA的表達(dá)

圖4 各組小鼠TNF－αmRNA和VEGFmRNA的光密度值比較

3 討論

糖尿病腎?。―N）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）代謝異常引起的‘腎小球硬化癥”，是DM常見的嚴(yán)重慢性微血管并發(fā)癥，最終發(fā)展為腎衰竭。DN引發(fā)的終末期腎功能衰竭（ESRD）正在成為威脅糖尿病患者生命的主要原因?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在控制血糖、血壓等基礎(chǔ)治療方面取得了很大的進(jìn)展，但在腎病治療方面尚無特殊進(jìn)展。DN的基本病理特征早期表現(xiàn)為腎小球高濾過、腎小球肥大，晚期表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增生、腎小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎功能衰竭。PI3K／Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞凋亡、代謝、增殖及分化等生命活動中發(fā)揮著重要功能，研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素可增加糖尿病大鼠腎臟AktmRNA的表達(dá)，進(jìn)而增加抗凋亡基因bcl－2的表達(dá)，影響NF－κB的表達(dá)，抑制糖尿病大鼠腎臟肥大，發(fā)揮保護(hù)腎功能[5]，二黃糖腎康也通過激活PI3K／Akt信號通路有效降低腎臟細(xì)胞凋亡[6]，但是PI3K／Akt信號通路在DN發(fā)病機(jī)制中具體是如何發(fā)揮作用的尚不清楚。

腫瘤壞死因子－α（TNF－α）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，一般情況下適量TNF－α可參與機(jī)體免疫反應(yīng)，具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等作用[7]。TNF－α也可通過多種機(jī)制作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)－內(nèi)分泌功能、介質(zhì)釋放、抗原遞呈等過程[8]，TNF－α刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，從而使過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物增多，造成細(xì)胞內(nèi)膜損傷，同時能刺激膠原的產(chǎn)生和成纖維細(xì)胞的增殖，加上糖基化膠原在血管壁的沉積，促使血管結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致DN等微血管病變[9]，雷帕霉素抑制糖尿病腎病大鼠的腎細(xì)胞凋亡可能是通過下調(diào)TNF－α、NF－κB的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[10]。但是在 DN 發(fā)病機(jī)制中，PI3K／Akt信號通路能夠通過調(diào)節(jié)TNF－α表達(dá)參與DN的調(diào)控尚未見文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DN大鼠經(jīng)靜脈注射Wortmannin處理后，腎組織內(nèi)TNF－α蛋白和mRNA的表達(dá)均顯著降低，結(jié)果提示 Wortmannin抑制PI3K／Akt信號通路后，TNF－α的表達(dá)也受到了抑制，說明在DN發(fā)病機(jī)制中，調(diào)節(jié)TNF－α的表達(dá)可能是PI3K／Akt信號通路參與DN調(diào)控的機(jī)制之一。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是體內(nèi)一種強(qiáng)效促血管生成因子，能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，直接或間接參與血管生成，增強(qiáng)血管通透性，缺血或缺氧是誘導(dǎo)VEGF上調(diào)的重要因素[11]，它主要通過與其酪氨酸激酶受體 VEGFR－l和VEGFR－2結(jié)合發(fā)揮作用，在炎癥、創(chuàng)傷愈合、心臟缺血、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等諸多與血管生成和組織愈合及再生、腫瘤形成等病理過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可促進(jìn)糖尿病小鼠腎小球新生血管生成，其表達(dá)上調(diào)與糖尿病腎臟病變密切相關(guān)[12－14]。但是在 DN 發(fā)病機(jī)制中，PI3K／Akt信號通路能夠通過調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)參與DN的調(diào)控尚未見文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DN大鼠經(jīng)靜脈注射 Wortmannin處理后，腎組織內(nèi)VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)均顯著降低，結(jié)果提示上調(diào)VEGF的表達(dá)可能是PI3K／Akt信號通路參與DN調(diào)控的機(jī)制之一。

本實(shí)驗結(jié)果的發(fā)現(xiàn)有利于PI3K／Akt信號通路參與DN調(diào)控的機(jī)制，能夠為DN的藥物治療提供一定參考依據(jù)。

[1]Kasinath BS，Mariappan MM，Sataranatarajan K，et al.Novel mechanismsof protein synthesis in diabetic nephropathy－role of mRNA translation[J].Rev Endocr Metab Disord，2008，9：255.

[2]landau D，Eshet R，Troib A，et al.Increased renal Akt／mTOR and MAPK signaling in type l diabetes in the absence of IGF type l receptor activation[J].Endocrine，2009，36（1）：126.

[3]Lloberas N，Cruzado JM，F(xiàn)ranquesa M，et al.Mammalian target of rapamycin pathway blockade slows progression of diabetic kidney disease，in rats[J].J Am Soc Nephrol，2006，17：1395.

[4]Andemn S，Rennke HG，Brenner BM.Nigedipine versus fosinopril inuninephrectomized Diabetic rats[J].Kidney Int，1992，41（4）：891.

[5]趙 燕，楊秋萍，劉 華，等.燈盞花素對糖尿病大鼠腎臟PI3K／AKT傳導(dǎo)通路的影響[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，（11）：58.

[6]常 庚，成秀梅，潘 莉，等.二黃糖腎康對糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及PI3K／Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29（19）：2471.

[7]Sun D，Colello RJ，Daugherty WP，et al.Cell proliferation and neuronal differentiation in the dentate gyrus in juvenile and adult rats following traumatic brain injury[J].J Neurotrauma，2005，22（1）：95.

[8]Urrea C，Castellanos DA，Sagen J，et al.Widespread cellular proliferation and focal neurogenesis after traumatic brain injury in the rat[J].Restor Neurol Neurosci，2007，25（1）：65.

[9]李梅君.糖尿病腎病患者 TNF－α、hsCRP的變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2009，49（49）：54.

[10]徐錦春，陳思嬌，熊 盈，等.TNF－α、NF－κB誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及雷帕霉素干預(yù)影響[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2012，21（2）：117.

[11]Manalo DJ，Rowan A，Lavoie T，et al.Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF－1[J].Blood，2005，105（2）：659.

[12]岳少妲，王 艷，馬瑞霞，等.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和內(nèi)抑素失衡在2型糖尿病腎病中的作用[J].醫(yī)師進(jìn)修雜志，2005，28（9A）：14.

[13]田河林，韋立順，許忠新，等.糖尿病小鼠腎小球微血管密度與VEGF表達(dá)的研究[J].中國病理生理雜志，2012，28（2）：358.

[14]趙 湜，王紅祥，邵詩穎，等.重組人促紅細(xì)胞生成素對糖尿病腎病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響及機(jī)制探討[J].中國醫(yī)師進(jìn)修雜志，2008，31（10A）：12.