人脂肪間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及凍存前后生物學變化

謝甬淋 戚飛騰 童洋萍 畢涌 張旭

人脂肪間充質(zhì)干細胞（human adipose－derived stem cells，hADSCs）最初是由Zuk等［1］從人脂肪組織中分離得到的一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞［2］。hADSCs在一定條件下可以分化成脂肪細胞、成骨細胞、骨細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞等，并且具有特殊的免疫調(diào)節(jié)作用［3］，常用于自身免疫性疾病的研究。hADSCs自抽脂手術(shù)廢棄的脂肪中分離［1］，取材豐富，無痛苦，不受倫理學限制，是具有巨大開發(fā)潛能的組織基因工程種子細胞。hADSCs體外培養(yǎng)周期較長，達到實驗所需細胞數(shù)量需要3～4周，要實現(xiàn)隨時為臨床和基礎(chǔ)研究提供足量的hADSCs，建立行之有效的凍存方法非常必要。確保凍存后細胞的存活率、增殖能力及細胞表面分子不受影響，是相關(guān)實驗研究順利進行的保障。本實驗旨在建立一種高效地分離及凍存hADSCs的方法，分析凍存前后hADSCs的生物學特征，為進一步探究其生物學作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 脂肪組織來自溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院整形科，捐贈者無重大疾病史，經(jīng)捐贈者同意。實驗設(shè)計通過溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。Ⅰ型膠原酶購自Worthington公司，胎牛血清、低糖DMEM購自Gibico公司，hADSCs完全培養(yǎng)基購自廣州賽業(yè)公司，細胞表面分子抗體購自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分離培養(yǎng):無菌條件下收集塊狀脂肪組織5～10g，浸泡在含有抗生素的低糖DMEM中。清除肉眼可見的血管組織，用含有抗生素的低糖DMEM反復(fù)沖洗3次以去除血細胞及其他雜質(zhì)，無菌剪刀將組織塊盡量剪碎。將脂肪組織置于雙倍體積的0.1%（質(zhì)量濃度）Ⅰ型膠原酶中，37℃震蕩水浴鍋中消化60min，每10min取出用力震蕩以促使組織充分消化。消化后加入等體積含10%（體積分數(shù)）胎牛血清的低糖DMEM，400 g離心10min。棄去上層油脂及未消化的脂肪組織，沉淀用紅細胞裂解液裂解10min后，400 g離心10min，低糖的DMEM清洗2次后，以100目篩網(wǎng)過濾、400 g離心10min。用hADSCs完全培養(yǎng)基重懸沉淀細胞后接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%（體積分數(shù)）CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，此后每隔2d換液1次，當細胞融合達80%～90%時，以0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 hADSCs凍存和復(fù)蘇:取對數(shù)期生長的第3代細胞，以0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化、以300 g離心5min，加入預(yù)冷的凍存液〔70%（體積分數(shù)）DMEM、20%（體積分數(shù)）胎牛血清、10%（體積分數(shù)）DMSO；均為終濃度〕重懸，調(diào)整細胞密度1×106／mL。置于程序降溫凍存盒中，－80℃過夜后轉(zhuǎn)移至液氮冰箱貯存。6個月后從液氮中取出細胞，立即置于38℃～40℃水浴鍋中迅速融化后轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有培養(yǎng)液的離心管中，以300 g離心5 min，hADSCs完全培養(yǎng)基重懸細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 復(fù)蘇后細胞存活率檢測:復(fù)蘇后，取適量細胞懸液，將細胞懸液與0.4%（質(zhì)量濃度）臺盼藍溶液按9∶1比例混勻，3min內(nèi)光鏡下觀察，計數(shù)被染成藍色的死細胞數(shù)和拒染的活細胞數(shù)，根據(jù)公式計算復(fù)蘇后細胞存活率。細胞存活率（%）＝活細胞數(shù)／（活細胞數(shù)＋死細胞數(shù)）×100%。

1.2.4 MTT法描繪細胞生長曲線:以0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化收集細胞，調(diào)整細胞密度至1×104／mL，接種至96孔板，每孔200μL，置37℃、5%（體積分數(shù)）CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于第2天開始，每天于同一時間隨機取1塊96孔板，每孔加入5mg／mL的MTT液20μL，37℃孵育4h，吸去上清，每孔加入150μL DMSO，震蕩混勻10 min。酶標儀上檢測450nm處吸光度值。連測8 d，以吸光度值為縱軸，時間（d）為橫軸繪制細胞生長曲線。吸光度值與細胞數(shù)量成正比。

1.2.5 hADSCs細胞表面分子檢測:0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化細胞，300 g離心5min，PBS清洗2次，調(diào)整細胞密度至1×106／mL。分別加入抗人CD44－FITC、CD105－APC、CD29－FITC、CD73－PE、CD31－PE、HLA－DR－APC，以 FITC－IgG1、APCIgG1、PE－IgG1為同型對照。于4℃、避光孵育30 min，PBS清洗2次，最后加入200μL PBS重懸上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 培養(yǎng)初期見大量懸浮細胞和脂肪滴，24h后細胞基本貼壁，呈圓形；3d后首次換液，可見少量長梭形細胞；6d后細胞融合基本達80%，細胞大小均等，成漩渦狀、編織狀生長。傳代培養(yǎng)后，4d后可達80%融合，細胞形態(tài)較均一，呈纖維細胞樣生長（圖1A）。復(fù)蘇后，hADSCs仍保持良好的生長狀態(tài)，第二天觀察貼壁良好，呈梭形（圖1B）。

圖1 第3代hADSCs凍存前（A）后（B）的形態(tài)（×100）

2.2 復(fù)蘇細胞存活率 復(fù)蘇后細胞存活率為（91.25±3.02）%。

2.3 凍存前后hADSCs生長曲線 凍存前后細胞生長曲線基本無差別，均呈“S”形。細胞經(jīng)過2～3d潛伏期后進入指數(shù)生長期，7d后進入平臺期，8d后細胞數(shù)稍有下降（圖2）。

圖2 凍存前后hADSCs生長曲線

2.4 凍存前后hADSCs細胞表面分子檢測 凍存前，CD44、CD105 雙陽性細胞占（99.850±0.001）%，CD29、CD73雙陽性細胞占（92.600±0.028）%，CD31陽性細胞占（4.186±0.010）%、HLA－DR陽性細胞占（1.02±0.007）%。凍存后，CD44、CD105雙陽性細胞占（98.060±0.028）%；CD29、CD73雙陽性細胞占（91.224±0.041）%；CD31陽性細胞占（3.832±0.009）%、HLA－DR陽性細胞占（1.514±0.006）%。各指標凍存前后比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明凍存前后hADSC均高度表達CD44、CD105、CD29、CD73，CD31、HLA－DR幾乎不表達。

3 討論

干細胞研究為實現(xiàn)組織和器官的修復(fù)帶來了新的技術(shù)革新。即使胚胎干細胞具有分化成為所有細胞類型的潛能，但由于其來源于胚胎組織，臨床應(yīng)用受到倫理限制，因此成體干細胞的研究將具有更加深遠的意義。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）最初從骨髓中提取，隨后研究證明在中胚層的其他組織如脂肪、胎盤、臍帶、滑膜等都能提取，來源豐富［4］。相對于骨髓 MSCs，脂肪來源的 MSCs，即hADSCs，取材于抽脂術(shù)或外科手術(shù)中棄去的皮下脂肪，可使患者免受抽骨髓取材的痛苦［5］。近年來研究顯示，MSCs具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力，可在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中抑制T細胞功能，改變輔助性T細胞（Th細胞）的平衡，誘導調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）產(chǎn)生［6］。Najar等研究指出hADSCs相比骨髓MSCs具有更強的免疫調(diào)節(jié)作用［7］，被視為治療自身免疫疾病如多發(fā)性硬化、移植物抗宿主病等比較理想的種子細胞［8］。因此，成功分離出hADSCs，實現(xiàn)其在體外擴增，是進一步探究其生物學作用和進行移植研究的基礎(chǔ)；而實現(xiàn)體外長期凍存hADSCs，隨時為臨床移植和科學研究提供充足干細胞，將是研究hADSCs的重要保障。

本實驗采用膠原酶消化與離心相結(jié)合的方法，從人腹部脂肪組織中高效分離出MSCs，其貼壁生長、形態(tài)為長梭形，具有良好的增殖能力，可在體外連續(xù)擴增傳代。凍存細胞時采用DMSO作為冷凍保護劑，利用程序降溫凍存盒實現(xiàn)“慢凍”，使細胞內(nèi)水分充分滲出，然后在液氮冰箱中長期保存細胞。與“4℃30min→－20℃2h→－0℃ 過夜→液氮保存”的緩慢降溫法相比，程序降溫凍存盒使用方便，避免了過多人為操作因素的影響。將細胞從液氮取出后在水浴鍋中立即融化，以實現(xiàn)“快融”，使細胞外冰晶迅速融化后進入細胞內(nèi)。此方法使復(fù)蘇后細胞存活率高，均達90%以上。本實驗通過描繪hADSCs細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，凍存前后細胞增殖能力未發(fā)生明顯變化，凍存對細胞增殖未產(chǎn)生較大影響。流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子，顯示凍存前后細胞均有 CD44、CD105、CD29、CD73高表達，CD31表達水平很低，HLA－DR幾乎不表達。CD44、CD105、CD29、CD73是基質(zhì)細胞的基本分子標記，hADSCs呈高表達；CD31為內(nèi)皮祖細胞的表面標記，hADSCs表達陰性［9］。hADSCs在未受刺激的狀態(tài)下不表達HLA－DR，但在INF－γ刺激時表達 HLA－DR［1］。本實驗取未受任何刺激的hADSCs檢測，結(jié)果與文獻報道相符。MSCs沒有特殊的表面標記，一般認為，長梭形貼壁細胞，同時表達CD44、CD105、CD29、CD73等表面分子，不表達CD31、HLA－DR等表面分子，可基本判定為 MSCs［10］。

綜上，本實驗成功分離出hADSCs，建立了將細胞長期凍存的方法，細胞復(fù)蘇后仍具有良好的增殖能力，生物學性狀未改變，這可能為hADSCs的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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