基于口服免疫耐受原理的人腫瘤小鼠荷瘤模型的建立

劉霞，成靜，范興文，周小兵，周丹，吳衛(wèi)疆，華曄，邵啟祥

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212001;3.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇鎮(zhèn)江212001)

腫瘤的發(fā)病原因和發(fā)生機制尚不完全清楚。因此，建立人類腫瘤的動物模型對研究腫瘤的發(fā)生機制和防治措施具有十分重要的意義。目前，腫瘤的動物模型大多是采用裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)等動物接種人類腫瘤細胞系而建立的;此外，通過給動物局部注射化學(xué)致癌劑也可誘發(fā)腫瘤。這兩種動物模型都有一定的缺點，首先，兩者均不符合腫瘤自然發(fā)生的模式。其次，前者的實驗動物價格昂貴，飼養(yǎng)環(huán)境要求高，易發(fā)生感染，影響實驗結(jié)果;后者接受的化學(xué)致癌劑的劑量在自然環(huán)境中幾乎是不可能的，其誘導(dǎo)的腫瘤類型比較單一，而且大量致癌劑的使用會造成環(huán)境污染。此外，還有一些采用基因修飾的腫瘤模型，與自然發(fā)生的腫瘤相差更遠［1-2］。本研究擬利用口服免疫耐受的原理，建立一種簡便、經(jīng)濟的特異性人肝癌小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細胞系(江蘇大學(xué)藥學(xué)院高靜教授惠贈)和人卵巢癌3AO細胞系 (上海市腫瘤研究所覃文新研究員惠贈)，用100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)液自行傳代培養(yǎng)。90只清潔級昆明種小鼠、6～8周齡，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2009-0002;實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2008-0024。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將90只小鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、無關(guān)腫瘤對照組和腫瘤模型組，每組30只。

1.2.2 基于口服免疫耐受的人腫瘤小鼠模型的建立

腫瘤模型組:小鼠以人肝癌HepG2細胞系(2×106個細胞/d)灌胃，連續(xù)7 d;無關(guān)腫瘤對照組:以同樣數(shù)量的人卵巢3AO細胞系連續(xù)灌胃7 d;空白對照組以等體積的生理鹽水連續(xù)灌胃7 d。然后，3組小鼠均于背部皮下接種HepG2細胞2×106/L。觀察并記錄腫瘤出現(xiàn)時間、腫瘤體積、腫瘤濕重、腫瘤生長速度、小鼠體質(zhì)量及生活習(xí)性的改變等。腫瘤的大小以游標卡尺每三天測量1次。按照文獻［3］，采用公式V=ab2/2(V=腫瘤體積，a=瘤體最長徑，b=瘤體最短徑)計算腫瘤體積。

1.2.3 腫瘤組織的病理學(xué)檢查 于腫瘤細胞接種后不同時間處死小鼠，剝離瘤體，去除四周脂肪組織，稱量腫瘤的重量，然后依次經(jīng)100 g/L甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤模型的建立

腫瘤模型組小鼠以HepG2細胞灌胃7 d后，皮下接種HepG2細胞的致瘤率達90%(27/30)，平均潛伏期為10 d(圖1)。無關(guān)腫瘤對照組和空白對照組灌胃7 d后皮下接種HepG2細胞，均未見腫瘤形成(圖2)。

圖1 注射肝癌細胞后的腫瘤形成率Fig 1 Incidence of tumor formation after cells injection

圖2 3組小鼠形成的腫瘤外觀Fig 2 Appearance changes of tumor formation in three groups

2.2 腫瘤的生長特點

腫瘤模型組小鼠皮下注射HepG2細胞后7～10 d，注射部位可觸及實質(zhì)性包塊，在接種后12～20 d時，處于快速生長期(圖3)。隨著腫瘤的生長，腫瘤的濕重不斷增加，但到后期(20 d后)，由于腫瘤發(fā)生壞死，腫瘤體積增長緩慢，甚至縮小(表1)。初期腫瘤表面一般有被膜，在晚期因腫瘤向深層肌肉浸潤而無明顯界限;腫瘤組織與皮膚黏連，皮膚可發(fā)生破潰或壞死，出現(xiàn)結(jié)痂(圖2F)。

圖3 注射HepG2細胞后小鼠體內(nèi)腫瘤生長速度Fig 3 The growth rate of HepG2 cells in mice

表1 接種HepG2細胞后不同時間腫瘤濕重、小鼠體質(zhì)量以及兩者之比的關(guān)系Tab 1 The relationship between tumor weight，body weight and the ratio at different time after HepG2 cells injection

2.3 腫瘤組織的病理學(xué)檢查

經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察，在毛細血管周圍，腫瘤細胞呈團狀(癌巢)或呈散在分布。腫瘤細胞的核較大，形態(tài)不一，核深染，核膜增厚，染色質(zhì)增多且分布不均勻。無關(guān)腫瘤對照組和空白對照組小鼠接種1周后接種處組織病理切片顯示仍有殘存的腫瘤細胞;接種2周后腫瘤細胞幾乎被小鼠機體的免疫系統(tǒng)清除，局部有大量浸潤的淋巴細胞與中性粒細胞，以及少數(shù)呈空泡狀的腫瘤細胞。見圖4。

圖4 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)(HE染色×400)Fig 4 Pathological changes of tumor tissues in different groups

3 討論

口服耐受是指口服某種抗原后，誘導(dǎo)局部腸相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphoid tissues，GALT)的特異性免疫，從而抑制全身對該抗原的特異性免疫應(yīng)答，但機體對其他抗原仍可產(chǎn)生正常的免疫性應(yīng)答［4］。抗原口服后，首先接觸到的是GALT中的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)。DCs捕獲抗原，處理后提呈給局部的T細胞，并誘導(dǎo)其分化為調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory T cells，Treg細胞)，Treg細胞可誘導(dǎo)機體對相應(yīng)抗原產(chǎn)生全身性免疫耐受［2，5］。根據(jù)這一原理，我們假設(shè)通過口服免疫耐受途徑可誘導(dǎo)腫瘤抗原對相應(yīng)的腫瘤細胞產(chǎn)生免疫耐受。本實驗給予小鼠較高劑量的人肝癌HepG2細胞系(2×106/L)連續(xù)灌胃7 d，試圖誘導(dǎo)小鼠對HepG2細胞產(chǎn)生特異性免疫耐受，然后再于背部皮下接種HepG2細胞。結(jié)果顯示，經(jīng)HepG2細胞灌胃的小鼠對接種的HepG2細胞不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，并可在其體內(nèi)生長形成腫瘤結(jié)節(jié);采用人卵巢癌3AO細胞系灌胃的小鼠對接種的HepG2細胞無容受性，不能在小鼠體內(nèi)生長形成腫瘤。上述結(jié)果表明，通過口服免疫可誘導(dǎo)出相應(yīng)腫瘤細胞的特異性免疫耐受?；诳诜庖吣褪艿脑恚⒛[瘤動物模型尚未見類似的報道。

口服抗原誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受的方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、食物過敏及器官移植等疾病的治療研究［6-8］。例如，口服胰島來源的自身抗原治療1型糖尿?。?］;口服糖基化雞2型膠原(UC-2，10 mg/d)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(女性患者)［10］;口服塵螨抗原治療過敏反應(yīng)［11］;口服牛Ⅱ型膠原(CⅡ)治療幼年性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［12］;口服耐受抑制實驗性卵巢早衰抗透明帶抗體的產(chǎn)生［13］;口服同源脊髓勻漿誘導(dǎo)昆明鼠耐受，治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎［14］等。

本研究基于口服免疫耐受的機制建立的人腫瘤動物荷瘤模型，比較符合自然過程發(fā)生的腫瘤，且可以較好地模擬腫瘤的病理過程，便于腫瘤發(fā)生機制和防治的研究。此外，該模型的制備操作簡便，成瘤率高，成本較裸鼠和SCID小鼠低，便于推廣。

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