有氧運動對衰老大鼠骨骼肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響

劉寧寧，李明學，金雯

(江蘇大學1.基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院，2.體育部，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

骨骼肌是人體重要的運動器官，其機能的下降是衰老的重要標志。骨骼肌衰老時，最大肌力與肌肉最大輸出功率明顯下降，主要與骨骼肌萎縮有關［1］。肌纖維總數(shù)不斷下降，從而產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的衰老性肌肉萎縮。從分子水平而言，肌纖維數(shù)目的減少是由于細胞凋亡而引起的［2］。增齡過程中，線粒體功能紊亂，導致肌細胞凋亡速度加快，肌纖維數(shù)量下降［3］。因此，可采取有效措施來降低骨骼肌細胞的凋亡，從而延緩肌肉衰老的發(fā)生發(fā)展。本文通過研究有氧運動對衰老模型大鼠骨骼肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，來探討有氧運動延緩骨骼肌細胞衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

D-半乳糖(Sigma公司)，Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體(Santa Cruz公司);HRP-羊抗大鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司);增強發(fā)光劑試劑盒(Amersham Biosciences公司);TUNEL檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗動物

21月齡雌性SD大鼠8只(老年對照組)，體質(zhì)量(400±10)g;3月齡雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±10)g。所有大鼠均由江蘇大學醫(yī)學實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，每籠8只，飼以標準嚙齒類動物飼料，不限制飲食，自由飲水，室溫18～23℃，相對濕度41% ～57%，適應性飼養(yǎng)1周后建造模型。

1.3 實驗分組及運動訓練

將40只3月齡雌性SD大鼠隨機分成青年對照組(n=8)和衰老模型組(n=32)，采用D-半乳糖腹部皮下注射法建立衰老模型［4－5］。用生理鹽水將D-半乳糖配置成5%的注射液，衰老模型組大鼠每天注射1次(500 mg/kg)，青年對照組則每天注射相應劑量的生理鹽水，連續(xù)注射6周。末次注射后，禁食12 h，分別處死青年對照組8只、老年對照組8只和衰老模型組(隨機選取8只)。

剩余的衰老模型組SD大鼠隨機分為3組，每組8只，分別為衰老模型對照組，3次/周運動組，6次/周運動組。運動采取無負重游泳的方式，水溫為(32±1)℃，水深為60 cm，并確保其不停地游泳。對照組則放入同樣溫度的淺水中。運動組首次游泳時間為30 min，然后以10 min/d遞加，直到90 min，以后保持不變。每次游泳結(jié)束后，用吹風機吹干大鼠皮毛，共訓練12周。

1.4 標本收集

造模結(jié)束時，分別取青年對照組、老年對照組和衰老模型組大鼠的左心室游離壁全層的心肌組織，用4%低聚甲醛固定24 h，再用蔗糖沉淀過夜。然后制作冰凍切片，厚度為10 μm，每個標本取不連續(xù)的2張，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，判斷模型建造情況。運動結(jié)束時，分別取衰老模型對照組及2組運動組大鼠的腓腸肌組織，各分成2份，一份同上述操作，用于TUNEL法檢測細胞凋亡情況;另一份則立刻－70℃凍存，用于蛋白質(zhì)檢測。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡

按照TUNEL法檢測細胞凋亡試劑盒的說明進行操作，然后于顯微鏡下觀察計數(shù)。呈藍色的為正常細胞，呈棕黃色的為凋亡細胞。每張切片選取5個高倍視野(×400)，對凋亡陽性細胞進行計數(shù)，每只大鼠取2張切片。根據(jù)公式:細胞凋亡指數(shù)=凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)，計算細胞凋亡指數(shù)。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達

制備蛋白樣品:取凍存的骨骼肌標本100 mg，加細胞裂解液1 mL，PMSF，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑各10 μL，置勻漿器于冰上勻漿30 min。然后，4℃離心，12 000×g，15 min。取上清，測定蛋白含量，再加入等體積的2×上樣緩沖液，混勻后煮沸3 min，－20℃保存?zhèn)溆谩５鞍讬z測:配制SDS-PAGE;每孔30 μg總蛋白量上樣;電泳;轉(zhuǎn)膜，一抗為1∶400的鼠抗Bax(Bcl-2)單克隆抗體，二抗為1∶5 000的HRP-羊抗鼠IgG;曝光;用ECL發(fā)光劑顯色。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老模型制備的結(jié)果

TUNEL染色結(jié)果顯示(圖1)，與青年對照組比較，老年對照組及衰老模型組的凋亡心肌細胞明顯增多，老年對照組的凋亡細胞與衰老模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義。老年對照組(33.692±2.766)與衰老模型組(34.146±2.931)的心肌細胞凋亡指數(shù)均顯著高于青年對照組(4.132±0.308)，P均＜0.05。衰老模型組的心肌細胞凋亡指數(shù)與老年對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=3.296，P=0.734)。

圖1 不同組大鼠心肌細胞TUNEL染色(×400)Fig 1 TUNEL staining of myocytes in different groups

2.2 骨骼肌細胞凋亡和Bcl-2、Bax的表達

與衰老模型對照組比較，3次/周運動組和6次/周運動組的骨骼肌細胞凋亡指數(shù)和Bax蛋白的表達均明顯降低，而Bcl-2蛋白的表達和Bcl-2與Bax比值明顯升高;與6次/周運動組相比，3次/周運動組骨骼肌細胞凋亡指數(shù)(t=2.928，P＜0.05)和 Bax的表達(t=3.478，P＜0.05)明顯降低，而Bcl-2表達(t=3.045，P＜0.05)和 Bcl-2與Bax比值明顯升高(t=4.643，P＜0.05)。見圖2、圖 3、表 1。

圖2 不同組大鼠骨骼肌細胞TUNEL染色(×400)Fig 2 TUNEL staining of skeletal muscle cells in different groups

表1 不同組骨骼肌細胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白的表達±sTab 1 Apoptosis index of skeletal muscle and exprssions of Bcl-2 and Bax in different groups

表1 不同組骨骼肌細胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白的表達±sTab 1 Apoptosis index of skeletal muscle and exprssions of Bcl-2 and Bax in different groups

a:P＜0.01，與對照組比較;b:P＜0.05，與6次/周運動組比較

±0.031 6次/周運動組(n=8) 44.680±2.060a 0.787±0.052a 0.877±0.025a 0.693±0.025a 3 次/周運動組(n=8) 41.130 ±2.175a，b 0.850 ±0.054a，b 0.790 ±0.014a，b 0.743 ±0.015a，b F值 8.452 10.348 16.756 5.639 P值/% Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax對照組(n=8) 48.960±4.163 0.590±0.031 1.053±0.042 0.620組別 凋亡指數(shù)0.007 0.006 0.004 0.009

圖3 免疫印跡法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達Fig 3 Western blot analysis of protein expressions of Bcl-2 and Bax

3 討論

D-半乳糖致衰老模型是我國學者基于衰老的代謝學說而復制的模型，系在一定的時間內(nèi)給動物連續(xù)注射D-半乳糖，使其細胞內(nèi)濃度增高，經(jīng)醛糖還原酶催化形成半乳糖醇，后者不能被進一步代謝而堆積于細胞內(nèi)，影響細胞滲透壓，導致細胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終致機體衰老。尹彤等［6］將自然衰老小鼠與D-半乳糖致衰老小鼠的重要臟器形態(tài)進行比較，結(jié)果顯示，D-半乳糖致衰老小鼠心臟病理組織學與自然衰老小鼠相似。Kajstura等［7］研究指出，24月齡小鼠的左心室心肌細胞凋亡發(fā)生率較16月齡小鼠增加了近2倍。這種心肌細胞凋亡隨齡性增加的現(xiàn)象，導致衰老小鼠的心肌細胞比青年小鼠減少了30%［7］。因此，衰老與否，可以用心肌細胞的凋亡來檢測，因其發(fā)生率隨年齡增加而增加，并且該現(xiàn)象僅局限于左心室的游離壁心肌細胞。本實驗對青年對照組大鼠、衰老模型組大鼠及老年對照組大鼠采用TUNEL法進行心肌細胞凋亡檢測。結(jié)果顯示，衰老模型組大鼠與老年對照組大鼠的心肌細胞凋亡指數(shù)均明顯高于青年對照組大鼠，且兩者比較相似，表明衰老模型大鼠可代替自然衰老大鼠進行本實驗的研究。

細胞凋亡是受多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因家族包括C-myc、抑癌基因P53等。Bcl-2家族蛋白在線粒體介導的凋亡通路中起重要調(diào)節(jié)作用，可分為2類:一類是抗凋亡，另一類是促凋亡。其中，Bcl-2和Bax這一對功能基因在細胞凋亡過程中起關鍵作用，兩者水平的高低與細胞凋亡直接相關。Bax增高，促進細胞凋亡;Bcl-2增高，則抑制細胞凋亡。Bax與Bcl-2兩者間的比例是決定細胞凋亡與否的關鍵因素［8］。Bax/Bcl-2＞1時，細胞趨向于凋亡;Bax/Bcl-2＜1時，細胞趨向于存活。隨著年齡的增加，增多的活性氧等物質(zhì)可誘導促凋亡蛋白Bax與Bcl-2結(jié)合的復合物解離并轉(zhuǎn)運至線粒體，使線粒體膜形成孔洞，釋放出細胞色素C，從而激活整個凋亡途徑［9］。吳薇等［10］的研究顯示，衰老小鼠的 Bcl-2 表達減少，Bax表達升高，Bax/Bcl-2比例升高，提示Bcl-2蛋白家族介導的凋亡通路被激活，線粒體膜的完整性被破壞，釋放出促凋亡物質(zhì)，促進細胞的凋亡。

運動訓練與細胞凋亡關系的實驗表明，適宜的運動強度不會引起細胞凋亡的增加;而力竭運動和超負荷運動時，大鼠細胞凋亡數(shù)量顯著增加，且運動強度與細胞凋亡的程度成正相關［11］。有氧運動可改變Bcl-2/Bax比值，從而影響骨骼肌細胞的凋亡。Song等［12］研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠在進行了12周的跑臺耐力訓練后，比目魚肌和腓腸肌中抗凋亡基因Bcl-2表達較對照組大鼠顯著增加，而Bax及Bax/Bcl-2比值均降低，比目魚肌和腓腸肌細胞凋亡指數(shù)隨之降低。Marzetti等［13］研究發(fā)現(xiàn)，28月齡的雄性Fischer 344大鼠骨骼肌凋亡率較8月齡雄性Fischer 344大鼠增加20.3%，而經(jīng)過4周的跑臺運動后，其骨骼肌細胞凋亡指數(shù)降低。Siu等［14］對成年SD大鼠進行8周中等強度的運動訓練后，檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，8周后運動組大鼠比目魚肌中Bcl-2表達較對照組增加，而Bax則較對照組下降。本研究表明，運動組經(jīng)過12周的有氧運動訓練后，均出現(xiàn)Bax蛋白表達下降，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值升高，骨骼肌細胞凋亡指數(shù)降低，且3次/周運動組的骨骼肌細胞凋亡指數(shù)較6次/周運動組下降得更明顯，這說明隔日運動更有利于延緩骨骼肌細胞衰老。

綜上所述，長期有氧運動可以降低骨骼肌細胞凋亡，可能是由于有氧運動造成骨骼肌細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達的變化而引起的。

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