中華鱉“腐皮、癤瘡”并發(fā)癥致病菌的病原分離與藥敏試驗(yàn)分析

曾 丹,鐘 蕾,羅方興,肖宗琳,謝偉偉,肖克宇 1

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 中國 長沙 410128)

中華鱉(Trionyxsinensis)，俗稱鱉、甲魚、王八、腳魚、水魚等[1]．是一種名貴的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其食用與藥用價(jià)值較高，在醫(yī)學(xué)上具有滋陰壯陽、利肝益腎、清熱消淤、破結(jié)軟堅(jiān)等功能[2]．中華鱉在我國廣泛分布，除新疆、西藏和青海外，其他各省均產(chǎn)．國外分布于越南、日本、帝汶島及夏威夷群島等地[3]．中華鱉的人工溫室養(yǎng)殖由于集約化程度高，養(yǎng)殖密度大，很容易滋生病菌，引起疾病發(fā)生[4]．譚北平[5]、姚金水[6]、李占魁[7]等研究了中華鱉腐皮病的病理組織、病原及防治方法．張開字[8]、雷道啟[9]、陳含華[10]等研究中華鱉癤瘡病得出控制溫度、養(yǎng)殖密度、水質(zhì)等因素是預(yù)防此病的有效措施．以上研究表明，中華鱉腐皮病的主要癥狀是頸部、尾部、背甲邊緣等處皮膚發(fā)生糜爛、壞死 ；中華鱉癤瘡病的主要癥狀是患病初期病鱉四肢基部、裙邊、腹甲、背甲以及脖頸長出白色小粒癤瘡，病情加重后癤瘡向外凸起，繼而潰爛成凹陷，炎癥進(jìn)一步擴(kuò)散，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)孔洞狀，可以見到內(nèi)臟．

本研究從湖南湘陰縣某養(yǎng)殖場(chǎng)采回的中華鱉病樣中，發(fā)現(xiàn)其均具有明顯的腐皮和癤瘡病癥狀，盡管目前對(duì)中華鱉癤瘡病、腐皮病的病因、發(fā)病規(guī)律和防治技術(shù)等方面的研究報(bào)道較多，但依地域和養(yǎng)殖環(huán)境的不同，其病原亦有差別，且有關(guān)中華鱉癤瘡、腐皮并發(fā)癥的病原分離與鑒定的報(bào)道少見．本實(shí)驗(yàn)對(duì)導(dǎo)致中華鱉癤瘡病、腐皮病并發(fā)癥的致病菌進(jìn)行了病原分離、生化鑒定和藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)出致病菌的耐藥性，為有效防治中華鱉腐皮、癤瘡并發(fā)癥提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料 取湖南省湘陰縣某中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)吊養(yǎng)的已呈明顯發(fā)病狀況且頻死的20個(gè)中華鱉，體重在0.1～1 kg之間．頭尾長0.18±0.02 m，寬0.09±0.01 m．確定患病中華鱉的標(biāo)準(zhǔn)：縮頭緩慢、背腹部斑塊、糜爛或孔洞等癥狀明顯．

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，H2O 1 L，pH 7.0．

1.2 方法

1.2.1 癥狀觀察與組織涂片 對(duì)采集的中華鱉病樣進(jìn)行肉眼觀察并解剖，記錄其主要癥狀．組織涂片后采用美蘭染色，顯微鏡油鏡觀察和顯微攝像．

1.2.2 病原菌分離 用接種環(huán)在病鱉腹部、背部和內(nèi)臟等病灶部位挑取組織液或內(nèi)臟勻漿液，分別在普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種, 于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h, 選取單個(gè)菌落接種于斜面, 再進(jìn)行平板劃線, 將分離到的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，保存至斜面?zhèn)溆茫?/p>

1.2.3 分離菌的菌落形態(tài)觀察及染色 對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落進(jìn)行觀察,并對(duì)其大小、形態(tài)、顏色、隆起度等特征進(jìn)行記錄．對(duì)分離純化的上述培養(yǎng)菌進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡觀察細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)及染色特征．

1.2.4 分離菌的生理生化特性檢查及菌種鑒定 采用API-20E鑒定系統(tǒng)和菌種鑒定管對(duì)純化菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)試(湖南天地人生物有限公司完成)，并人工補(bǔ)充其他的生理生化實(shí)驗(yàn)．細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]方法進(jìn)行．

1.2.5 人工感染試驗(yàn) 將16 h的細(xì)菌培養(yǎng)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.70%的無菌鹽水制成菌懸液，選取0.4 kg左右健康的中華鱉各10尾，分別進(jìn)行腹腔注射感染和創(chuàng)傷浸泡感染,每尾腹腔注射劑量為0.5 mL, 菌液濃度稀釋為1.0×109個(gè)/mL, 同時(shí)以注射等量無菌生理鹽水的健康中華鱉作為對(duì)照；創(chuàng)傷浸泡感染先用滅菌針頭在中華鱉背腹部和腿部劃痕, 再將其放置在含有2.0×109個(gè)/mL病原菌的水體中浸泡24 h, 然后在裝有清水的水族箱中進(jìn)行飼養(yǎng)觀察，同時(shí)對(duì)照組用清水浸泡．水溫控制在25～28 ℃，連續(xù)14 d觀察并記錄試驗(yàn)中華鱉的病癥及死亡數(shù)目, 計(jì)算其死亡率．同時(shí)對(duì)人工感染發(fā)病瀕死的中華鱉進(jìn)行病原菌再分離, 檢查所分離的菌株與原分離菌株在形態(tài)與理化特性等方面是否一致．

1.2.6 藥物敏感試驗(yàn) 將從患病中華鱉中分離出的菌株用無菌水調(diào)配成(1.0～1.5)×108個(gè)/mL的菌懸液(相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?．取菌懸液 0.1 mL 放于無菌平皿中央，用涂布棒涂勻．在涂菌平板上均勻粘貼抗生素藥敏紙片，每皿貼5～6片不同的藥皿紙片，片間距離不少于 24 mm，紙片中心距平板邊緣不少于 15 mm．將貼有藥敏片的平板放于28 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 24 h，取出后測(cè)量各個(gè)抑菌圈直徑．根據(jù)抑菌圈直徑大小結(jié)合《藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性．藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司．由長沙天地人生物有限公司鑒定并提供結(jié)果．

2 結(jié)果

2.1 癥狀觀察

觀察自然發(fā)病和人工感染發(fā)病的中華鱉，發(fā)現(xiàn)其癥狀基本類似，主要為腿部和裙邊出現(xiàn)明顯紅腫、糜爛，腹甲、背甲以及脖頸長出白色小粒癤瘡，病情加重后癤瘡向外凸起，繼而潰爛成凹陷呈現(xiàn)孔洞狀，解剖可見腹腔積水，內(nèi)臟充血，肝臟明顯腫大(如圖1)．

2.2 美蘭染色鏡檢結(jié)果

分別從患該病中華鱉的背甲、腹甲、肝臟、脾臟等處取樣，用病變組織涂片進(jìn)行美蘭染色和光學(xué)顯微鏡鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量細(xì)菌存在(見圖2)．

(a)背部潰瘍和癤瘡；(b)腹部白色突出物；(c)肝臟明顯腫大；(d)腹腔積水 (a)背甲；(b)腹甲；(c)肝臟；(d)脾臟圖1 發(fā)病中華鱉的體表和內(nèi)臟病變(箭頭所示) 圖2 病變組織美蘭染色鏡檢結(jié)果(10×40)Fig.1 The body surface and viscera lesions of infected trionyx sinensis Fig.2 Lesions methylene blue staining microscopic examination results

2.3 分離菌的菌落形態(tài)及染色結(jié)果

從患病中華鱉的內(nèi)臟、四肢和背腹甲中共分離篩選得到2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，分別標(biāo)記為Z2012-1和Z2012-2．革蘭氏染色顯示兩者均為革蘭氏陰性短桿菌菌落形態(tài)(見表1)．

表1 Z2012-1和Z2012-2的菌落形態(tài)特征Tab.1 Colony shape features of Z2012-1 and Z2012-2

2.4 分離菌株的生理生化特性

根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征，人工生化試驗(yàn)結(jié)果以及長沙天地人生物有限公司生化鑒定儀鑒定結(jié)果，將Z2012-1和Z2012-2菌株的生化特征匯總于表2，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，確定Z2012-1和Z2012-2菌株分別為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffi)．

表2 生理生化反應(yīng)Tab.2 Isolates physiological and biochemical reactions

2.5 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

用兩種菌1∶1混合感染健康中華鱉，經(jīng)腹腔注射和浸泡感染進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)鱉均出現(xiàn)病癥，其中腹部注射發(fā)病較快，第6天出現(xiàn)死亡，連續(xù)觀察15天死亡率達(dá)100%；而浸泡感染發(fā)病較慢，中華鱉先是行動(dòng)遲緩，體表出現(xiàn)小白點(diǎn)，然后停止進(jìn)食，直至第10天陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡率為60%(表3)．經(jīng)解剖觀察，患病中華鱉出現(xiàn)與正常養(yǎng)殖中發(fā)病中華鱉(圖1)相似癥狀，病鱉體表多處潰瘍和癤瘡、肝臟腫大充血，并伴隨大量腹水從體內(nèi)流出．從人工感染瀕死的中華鱉體內(nèi)又分離到與原分離菌株形態(tài)特征及生理生化特性一致的細(xì)菌．

表3 健康中華鱉人工感染結(jié)果Tab.3 Results of artificial infection to healthy trionyx sinensis

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表4可以看出，嗜水氣單胞菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、美洛培南、復(fù)方新諾明、氯霉素等藥物高度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩等藥物中度敏感，對(duì)四環(huán)素、頭孢西丁等藥物具有耐藥性．洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、左氟沙星、氧氟沙星、美洛培南、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素等藥物高度敏感，對(duì)氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、粘菌素等藥物中度敏感，對(duì)哌拉西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素等具有耐藥性．

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The results of sensitivity test of antibacterial drugs

3 討論

目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)引起中華鱉“腐皮、癤瘡”并發(fā)癥的主要致病菌的研究有一些，但尚未深入．近年來國內(nèi)學(xué)者陸續(xù)報(bào)道不動(dòng)桿菌可與嗜水氣單胞菌等細(xì)菌混合感染水產(chǎn)動(dòng)物，引起各種疾?。人畾鈫伟?Aeromonashydrophila)屬弧菌科,為革蘭氏陰性短桿菌，對(duì)環(huán)境要求不高，廣泛分布在江、河、湖中，是魚類、兩棲類、爬行類和哺乳動(dòng)物的致病菌[13-14]．它能引發(fā)多種水生動(dòng)物的傳染病,有關(guān)嗜水氣單胞菌致病性的研究，已有過大量的報(bào)道[15]．但有關(guān)洛菲不動(dòng)桿菌在中華鱉細(xì)菌性疫病中出現(xiàn)的頻率和致病機(jī)理尚未見報(bào)道．洛菲不動(dòng)桿菌也稱魯氏不動(dòng)桿菌，為條件致病菌，廣泛分布于土壤、水體和污水中．一般認(rèn)為不動(dòng)桿菌的毒力很低，在機(jī)體抵抗力下降或免疫功能受損時(shí)易出現(xiàn)感染．在水產(chǎn)動(dòng)物病害中, 洛菲不動(dòng)桿菌可引起歐洲鰻鱺“紅頭病”[16]、胡子鲇“吊頭病”[17]、金魚“突眼病”[18]、鱖魚的某種細(xì)菌病[19]、美國青蛙“抽搐癥”[20]等．而本研究中由嗜水氣單胞菌和洛菲不動(dòng)桿菌感染引起中華鱉癤瘡、腐皮并發(fā)癥的報(bào)道，在國內(nèi)尚屬首次．

本實(shí)驗(yàn)從病鱉體平板劃線法分離出致病菌，培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)致病菌進(jìn)行生理生化鑒定．再對(duì)致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)出致病菌對(duì)不同藥物的耐藥性情況．試驗(yàn)表明，嗜水氣單胞菌和洛菲不動(dòng)桿菌這2種病原菌對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、左氟沙星、美洛培南、阿米卡星、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素等藥物敏感，對(duì)四環(huán)素、哌拉西林、慶大霉素不敏感，這對(duì)以后中華鱉集約化養(yǎng)殖過程中疾病的預(yù)防與治療提供理論基礎(chǔ)．

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