秋水仙堿與人血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)和電化學(xué)研究

佘 佩, 吳 瓊, 曹文英, 吳軍軍

(湖北大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 湖北 武漢 430062)

從分子水平闡述蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子與具有生物活性的小分子間的相互作用特征是涉及化學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)等學(xué)科的交叉課題，人們一直嘗試用各種物理和化學(xué)方法來獲取這方面的信息，以探討生命過程的規(guī)律. 目前，在研究藥物小分子與生物大分子相互作用的各種方法中，光譜方法，尤其是熒光光譜和紫外光譜等方法因其靈敏度高、選擇性強(qiáng)、樣品用量少、操作方法簡(jiǎn)便以及能提供較多的物理參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用[1]. 近年來，電化學(xué)方法對(duì)小分子同蛋白質(zhì)相互作用的研究也引起了人們的廣泛興趣.

秋水仙堿(colchicine，COLC，分子式為C22H25NO6)在臨床上主要用作抗腫瘤藥，可用于乳腺癌、皮膚癌、食道癌等的防治，也有研究表明秋水仙堿可用作肺炎、肝臟等疾病患者的鎮(zhèn)定劑[2-3]. 血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合[4-5]. 藥物進(jìn)入體內(nèi)后，要通過血漿的貯存與運(yùn)輸，達(dá)到受體部位，進(jìn)而發(fā)生藥理作用. 因此，蛋白質(zhì)與藥物的相互作用不僅影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布，而且還影響藥物在體內(nèi)的代謝與排泄方式等. 目前，有關(guān)秋水仙堿與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的研究已有較多報(bào)道[6-9]，而秋水仙堿與人血清白蛋白(HSA)相互作用的研究較少，且尚未見到用電化學(xué)方法研究秋水仙堿與HSA相互作用的相關(guān)文獻(xiàn).

為了更全面準(zhǔn)確地把握藥物與生物大分子的作用機(jī)制，往往需要同時(shí)采用多種現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)或方法，更適時(shí)、原位地追蹤小分子進(jìn)入生命體內(nèi)與生物大分子的相互作用，以獲得更可靠的結(jié)果. 作者主要利用熒光光譜、紫外光譜等光譜學(xué)方法和循環(huán)伏安(CV)、差示脈沖伏安(DPV)等電化學(xué)方法，研究在近似生理?xiàng)l件下秋水仙堿與HSA的相互作用. 從分子水平探討其作用機(jī)制，分析秋水仙堿對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；研究秋水仙堿與HSA相互作用的電化學(xué)行為；并分別用光譜學(xué)和電化學(xué)方法測(cè)定相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及溶液

秋水仙堿(Sigma)，人血清白蛋白(Sigma). 實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次超純水. 所有溶液均用pH=7.4的PBS緩沖溶液配制.

1.2 熒光光譜

用LS-55熒光分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司)，測(cè)定研究體系溶液的熒光光譜. 選定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為15 nm, 以290 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，繪制研究體系的熒光發(fā)射光譜；固定Δλ=60 nm，記錄秋水仙堿與HSA作用的同步熒光光譜.

1.3 紫外-可見吸收光譜

用Lambda-35紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司)，測(cè)定各溶液的吸收光譜. 波長(zhǎng)范圍450～190 nm.

1.4 電化學(xué)測(cè)量

電極處理：將工作電極(玻碳電極)先用0.05 μmγ-Al2O3拋光粉的懸糊液拋光成鏡面，再依次在去離子水、無水乙醇、去離子水中各超聲兩次，每次清洗5 min；然后放入PBS溶液中，于-0.6 ～ 0.6 V電位下進(jìn)行掃描極化處理，CV曲線平滑無峰，則說明電極無異物；接著放入1.0×10-3mol·L-1K3[Fe(CN)6] 和1.0mol·L-1KCl混合溶液中掃描CV圖，當(dāng)電極的氧化還原電位差小于70 mV時(shí)即可使用；最后將其放入0.5 mol·L-1H2SO4溶液中進(jìn)行活化.

電化學(xué)測(cè)量：CHI 660a電化學(xué)工作站(上海辰華有限公司)，三電極工作體系(玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、金電極為對(duì)電極)，CV測(cè)量在pH=7.4的PBS緩沖溶液中進(jìn)行，電位范圍0.8 ～ 1.35 V，掃描速度0.1 V·s-1；在相同的電位范圍對(duì)秋水仙堿與HSA反應(yīng)體系進(jìn)行DPV測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 秋水仙堿與HSA相互作用的熒光光譜及猝滅機(jī)理

蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等能產(chǎn)生熒光的氨基酸基團(tuán)，這三種氨基酸的熒光強(qiáng)度比大約為100∶9∶0.5，因此通常情況下可以認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自Trp殘基的貢獻(xiàn)，通過檢測(cè)加入秋水仙堿前后HSA的內(nèi)源熒光變化情況來表征藥物與HSA的結(jié)合關(guān)系. 而蛋白質(zhì)分子的熒光光譜會(huì)隨溶劑極性變化而發(fā)生紅移或藍(lán)移，因此根據(jù)這一規(guī)律可以推斷氨基酸殘基所處環(huán)境及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化等信息[10].

為了突出血清白蛋白的熒光來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn)而降低酪氨酸和苯丙氨酸殘基的影響，作者利用HSA分子中色氨酸殘基的內(nèi)源熒光，以λex=290 nm激發(fā)，在340 nm附近有很強(qiáng)的熒光峰；而以同樣激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)秋水仙堿溶液時(shí)，在340 nm附近則沒有熒光峰，表明秋水仙堿不會(huì)產(chǎn)生與HSA相互干擾的熒光. 固定HSA的濃度為2.0 μmol·L-1，隨著體系中秋水仙堿濃度的增加，HSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅(圖1). 從圖1可以看出，隨著秋水仙堿的加入及其濃度增大，其熒光強(qiáng)度降低，且伴隨著最大發(fā)射波長(zhǎng)明顯的藍(lán)移(最大發(fā)射波長(zhǎng)從343 nm藍(lán)移到322 nm)，表明HSA與秋水仙堿的作用使其發(fā)色團(tuán)微環(huán)境發(fā)生了變化，即色氨酸殘基所處環(huán)境極性減弱，疏水性增強(qiáng).

c(HSA) = 2.0 μmol·L-1; c(COLC)/(10-5 mol·L-1), A-G: 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0.; curve N shows the emission spectrum of colchicine only, c(COLC)= 1.0×10-5 mol·L-1. The inset corresponds to the Stern-Volmer plot圖1 秋水仙堿濃度對(duì)HSA熒光發(fā)射光譜的影響Fig.1 Emission spectra of HSA in the presence of various concentrations of colchicine

熒光猝滅過程分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、混合猝滅等，為了研究和討論的方便，通常將其分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅. 動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程，主要依賴于分子擴(kuò)散；靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)熒光的配合物，從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的過程. 無論是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，其過程均遵循Stern-Volmer方程[11]：

τ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑的濃度，kq是生物大分子的猝滅速率常數(shù)，τ0(10-8s) 是無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命，KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù). 根據(jù)熒光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以F0/F對(duì)相應(yīng)的[Q]作圖，得到秋水仙堿對(duì)HSA猝滅的Stern-Volmer曲線(圖1插圖)，由直線斜率求出KSV= 7.56×104L·mol-1，kq= 7.56×1012L·mol-1·s-1.kq的值比各類熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)[12]大得多，所以猝滅過程不是動(dòng)態(tài)猝滅過程，而是秋水仙堿和HSA形成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程.

由于動(dòng)態(tài)猝滅只涉及熒光分子的激發(fā)態(tài)，因而猝滅劑對(duì)熒光物質(zhì)的吸收光譜一般不產(chǎn)生影響；而基態(tài)配合物的生成往往會(huì)導(dǎo)致熒光物質(zhì)吸收光譜的改變[13]. 為了進(jìn)一步驗(yàn)證秋水仙堿對(duì)HSA的靜態(tài)猝滅機(jī)理，實(shí)驗(yàn)考查了HSA與秋水仙堿作用的紫外吸收光譜.

圖2為室溫條件下2.0 μmol·L-1的秋水仙堿溶液的紫外吸收(曲線A)、2.0 μmol·L-1的HSA溶液的紫外吸收(曲線B)以及秋水仙堿與HSA的物質(zhì)的量之比為1∶1的混合物與秋水仙堿的紫外吸收差譜(曲線C). 從圖2可以看出，B和C兩曲線有明顯差別，表明秋水仙堿的加入使HSA的紫外吸收發(fā)生了變化，秋水仙堿對(duì)HSA的熒光猝滅是它與HSA生成基態(tài)配合物的結(jié)果。進(jìn)一步推斷秋水仙堿-HSA體系的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅機(jī)制.

2.2 秋水仙堿對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

同步熒光光譜因具有譜圖簡(jiǎn)化(減少譜圖重疊)、譜帶變窄、光散射干擾減少等優(yōu)點(diǎn)而常被用來分析藥物對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的影響[14]. 通過選擇合適的波長(zhǎng)差，可將在普通熒光光譜上相互重疊的不同發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生的熒光峰分開，如固定Δλ=60 nm和Δλ=15 nm所作出的同步熒光光譜分別表現(xiàn)出色氨酸殘基和酪氨酸殘基的光譜特征[15]. 因氨基酸殘基的最大吸收波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，因此，由最大發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn)生的位移情況，可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化. 發(fā)射波長(zhǎng)紅移表明氨基酸殘基所處環(huán)境的極性增加(疏水性逐漸降低)，藍(lán)移則疏水性增加. 因色氨酸的最大熒光發(fā)射峰位對(duì)環(huán)境很敏感，通常作色氨酸殘基的同步熒光光譜，以此作為定性判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的依據(jù).

固定HSA的濃度，逐漸增大秋水仙堿的濃度，記錄Δλ=60 nm時(shí)的同步熒光光譜(圖3).由圖3可見，HSA-秋水仙堿體系的同步熒光光譜發(fā)生藍(lán)移(從279 nm位移至276 nm). 表明秋水仙堿的加入使HSA的構(gòu)象發(fā)生了一定的變化，色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性有所增強(qiáng)，HSA內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定.

2.3 秋水仙堿的電化學(xué)行為

秋水仙堿是一種電活性物質(zhì)，在玻碳電極上的循環(huán)伏安(CV)掃描圖見圖4，陽(yáng)極掃描有一個(gè)氧化峰，陰極掃描無峰，說明秋水仙堿在玻碳電極上的氧化是不可逆的. 其峰的位置隨著底液不同而移動(dòng)；改變電位掃描速度，觀察掃描速度對(duì)氧化峰的峰電流的影響，發(fā)現(xiàn)峰電流與掃速的一次方呈良好的線性關(guān)系. 由此可知，秋水仙堿在玻碳電極上的電化學(xué)反應(yīng)是受吸附控制的[16].

采用測(cè)定靈敏度高，分辨率好的差示脈沖伏安法(DPV)對(duì)體系進(jìn)行研究和測(cè)定.富集時(shí)間從0 s變化到160 s，發(fā)現(xiàn)秋水仙堿的氧化峰電流基本保持不變，說明富集時(shí)間對(duì)秋水仙堿在玻碳電極上的氧化峰電流沒有影響，為了節(jié)約反應(yīng)時(shí)間，我們選擇10 s為本實(shí)驗(yàn)的富集時(shí)間. 富集電位在1.1 ～ -0.2 V變化時(shí)，秋水仙堿的氧化峰電流在0.9 V時(shí)最大，因此我們選擇0.9 V為本實(shí)驗(yàn)的富集電位.

選定實(shí)驗(yàn)條件下，氧化峰峰電流與秋水仙堿的濃度在1.2×10-5～ 8.1×10-4mol·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系)(圖5)，線性回歸方程為:ipa/A =1.62×10-7+ 0.12c(COLC)/(mol·L-1)，R=0.996 0.

c(HSA) = c(COLC) = 2.0 μmol·L-1圖2 秋水仙堿對(duì)HSA吸收光譜的影響Fig.2 Absorption spectra of colchicines-HSA system

c(HSA) = 2.0 μmol·L-1; c(COLC)/(10-5 mol·L-1), A-G: 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0圖3 秋水仙堿與HSA作用的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of HSA in the presence of colchicine

c(COLC) = 1.0×10-4 mol·L-1; v=0.1 V·s-1圖4 秋水仙堿的CV圖Fig.4 Voltammogram of COLC

c(COLC)/(10-4 mol·L-1), A-I: 0.12, 0.32, 0.62, 1.1, 2.4, 3.2, 5.2, 6.6, 8.1. Inset: plots of the oxidative current and concentration of COLC圖5 不同濃度秋水仙堿的DPV圖Fig.5 DPV of COLC at different concentrations

2.4 秋水仙堿與HSA相互作用的差示脈沖伏安研究

我們用差示脈沖伏安法對(duì)秋水仙堿與HSA二者的反應(yīng)體系進(jìn)行了電化學(xué)研究. 在pH=7.4的PBS緩沖溶液中加入適量的HSA，在0.95～1.26 V范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行DPV掃描，無峰出現(xiàn)，與在底液中掃描的基線基本重合，而秋水仙堿在此濃度范圍內(nèi)有一靈敏的氧化峰，峰電位為1.18 V(vs. SCE). 當(dāng)將HSA加入到秋水仙堿溶液中后，秋水仙堿的氧化峰電流減弱，峰電位正移(圖6)，這是由于秋水仙堿與HSA相互作用，生成了秋水仙堿-HSA非電活性化合物，二者結(jié)合使得游離的秋水仙堿濃度降低，從而導(dǎo)致峰電流降低[17].

2.5 秋水仙堿與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

對(duì)于靜態(tài)猝滅，其熒光猝滅數(shù)據(jù)可用修正的Stern-Volmer方程進(jìn)行處理[18]：

(2)

式中ΔF為加入猝滅劑前后熒光強(qiáng)度的變化，fa為蛋白質(zhì)(熒光基團(tuán))可接近猝滅劑的部分(分?jǐn)?shù))；Ka為有效猝滅常數(shù)，可用作結(jié)合常數(shù). 以F0/ΔF對(duì)1/[Q]作圖，即可求得蛋白質(zhì)與秋水仙堿的結(jié)合常數(shù)Ka. 直線擬合方程為：F0/ΔF=2.98×10-5/[Q]+0.605，R=0.991 0. 由此求得秋水仙堿與HSA的結(jié)合常數(shù)為Ka=2.03×104L·mol-1. 秋水仙堿與HSA的結(jié)合常數(shù)較大，說明秋水仙堿與血清白蛋白有強(qiáng)的結(jié)合，可以通過HSA攜帶而在體內(nèi)儲(chǔ)存和運(yùn)輸從而通過血液循環(huán)達(dá)到作用部位，發(fā)揮效果.

假設(shè)生物大分子的若干個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是獨(dú)立且相同的，根據(jù)小分子與大分子的配位方程[19]：

(3)

式中Kb與n分別是表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù). 根據(jù)(3)式，以lg((F0-F)/F) 對(duì)lg[Q]作圖，由直線斜率求出秋水仙堿與HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.31. 秋水仙堿與HSA作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，表明它們之間可以形成一個(gè)強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn).

為了證實(shí)光譜法所得結(jié)果，在優(yōu)化條件下，用差示脈沖伏安法測(cè)定了秋水仙堿與HSA作用體系的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù). 假定秋水仙堿與HSA結(jié)合形成一種簡(jiǎn)單的化合物HSA-nCOLC，即

其中ΔI表示加入HSA前后秋水仙堿峰電流的差值，ΔImax表示的是峰電流的最大差值，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù). 圖7為HSA濃度固定為2.0 μmol·L-1時(shí)，改變秋水仙堿的濃度所得的氧化峰電流曲線.

c(COLC) = 1.0×10-4 mol·L-1;c(HSA), A-D: 0, 1.0, 2.0, 3.0 μmol·L-1圖6 秋水仙堿與HSA反應(yīng)的DPV圖Fig.6 DPV of COLC-HSA reaction system

A: The current of COLC in the absence of HSA; B: the current of COLC in the presence of HSA; C: the difference between A and B圖7 氧化峰電流與秋水仙堿濃度的關(guān)系Fig.7 Plots of the oxidation peak current versus c(COLC)

結(jié)論：用熒光光譜、紫外吸收光譜和電化學(xué)方法研究在近似生理?xiàng)l件下秋水仙堿與人血清白蛋白(HSA)的相互作用. 研究表明，秋水仙堿與HSA的結(jié)合主要是兩者形成基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程，秋水仙堿的加入使HSA的構(gòu)象發(fā)生變化，色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性有所增強(qiáng). 在pH=7.4的PBS緩沖溶液中，秋水仙堿在玻碳電極上產(chǎn)生一不可逆的氧化峰，峰電位在1.18 V(vs. SCE). 加入HSA后秋水仙堿的氧化峰電位正移，峰電流下降. 用光譜學(xué)和電化學(xué)方法測(cè)定秋水仙堿與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為：K=2.03×104L·mol-1，n=1.31和K=1.95×104L·mol-1，n=1.20. 說明秋水仙堿與HSA之間有較強(qiáng)結(jié)合，秋水仙堿可以通過HSA攜帶而在體內(nèi)儲(chǔ)存和運(yùn)輸從而通過血液循環(huán)達(dá)到作用部位，發(fā)揮效果.

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