塑化劑DEHP與植物雌激素GEN孕期暴露對雄性子代大鼠發(fā)育影響

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科（西安710004）李和程 張連棟 高 明 王 磊 鄧 騫 種 鐵 王子明

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Environmental endocrine disruptors，EED）暴露對生態(tài)環(huán)境和人類健康的影響一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近20余年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為胚胎期或圍出生期環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露是近50余年來男性精子密度下降以及隱睪、尿道下裂和睪丸腫瘤發(fā)病率增高的重要原因［1］。具有抗雄激素作用的鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯（DEHP）暴露對子代有較為確切的生殖毒性。染料木黃酮（GEN）攝入量與人類精子密度負(fù)相關(guān)，體外試驗(yàn)證實(shí)低劑量GEN可以增強(qiáng)精子頂體反應(yīng)，對其他環(huán)境內(nèi)分泌干擾物造成的損傷有拮抗作用。本研究通過建立妊娠期大鼠同時暴露于DEHP與GEN動物模型，探討兩者對雄性子代發(fā)育是否具有協(xié)同亦或是拮抗作用。

材料與方法

1 試劑與儀器 鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；染料木黃酮購自西安陜西慧科植物開發(fā)公司；Mettler AG285電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；游標(biāo)卡尺（杭州錢塘江工具量具有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)動物處置 健康成年SPF級SD雌性大鼠30只（體重200±20g）和雄性15只（體重300±30g）由西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律采光，室溫18～24℃，飼料不含豆類以及苜蓿（Soy-and alfalfa-free diet，SAFD），自由飲用凈化水。

3 實(shí)驗(yàn)方法 SPF級雌性SD大鼠30只，雄鼠15只，雌性大鼠按2∶1與雄性大鼠同籠交配，次日晨將雌鼠逐一陰道涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日記為孕期零天（GD0）。發(fā)現(xiàn)精子后取出雄鼠，雌鼠每籠一只，將所獲30只孕鼠隨機(jī)分到以下5組，每組6只。A組為對照組，僅灌胃花生油（2ml／kg）；B組為 DEHP（250mg／kg）組；C 組為 DEHP（250mg／kg）+低劑量 GEN（50mg／kg）組；D 組為 DEHP（250mg／kg）+高劑量GEN（400mg／kg）組；E組為高劑量 GEN（400mg／kg）組。在親代雌鼠的孕3d（GD3）至孕20d（GD20），每天按分組方案灌胃。于出生后第1天（Postnatal day 1，PND1）時，計(jì)數(shù)各組子代雌雄幼鼠活產(chǎn)只數(shù)、雌雄比例，對子代雄鼠稱重的稱重同時測量肛門生殖器距離（AGD），計(jì)算 AGD／體重1／3，并記錄母鼠體重變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較首先檢驗(yàn)資料的正態(tài)性和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 PND1各組子代大鼠發(fā)育情況 見附表。30只雌鼠順利產(chǎn)仔，PND1各組幼鼠每窩活產(chǎn)只數(shù)、雌雄比例無顯著性差異。雄性子代大鼠體重C組較A組有顯著性降低（P＜0.05），D組較A組有極顯著性差異（P＜0.01），D組較B、C、E組均有顯著性降低（P＜0.05）。各組AGD／體重1／3無顯著性差異（P＞0.05）。

附表 PND1各組子代大鼠指標(biāo)（±s）

附表 PND1各組子代大鼠指標(biāo)（±s）

注：＊ 與A組比較，P＜0.05；＊＊ 與A組比較，P＜0.01；＃ 與B組比較，P＜0.05；△ 與C組比較，P＜0.05；■ 與E組比較，P＜0.05

組 別 母鼠只數(shù) 平均每窩活產(chǎn)只數(shù) 仔鼠只數(shù) 出生性別比（雌∶雄）子代雄鼠體重（g）母鼠體重變化GD3-GD21（g）A 6 12.5±1.64 75 0.92∶1 6.60±0.89 110±15.4 B 6 12.33±1.86 74 0.85∶1 6.27±0.81 98±10.1 C 6 13.33±1.75 80 0.91∶1 6.14±0.37＊ 96±6.7 D 6 13.0±1.79 78 1.05∶1 5.24±0.81＃△■＊＊ 101±13.9 E 6 11.67±1.75 70 1.12∶1 6.23±0.72 114±19.3

2 PND1各組子代雄性大鼠AGD／體重1／3見附圖。于PND1測量各組子代雄鼠體重及肛門生殖器距離，計(jì)算 AGD／體重1／3。各組 AGD／體重1／3無顯著性差異（P＞0.05），但D組較對照組有下降趨勢。

附圖 PND1各組子代雄性大鼠AGD／體重1／3

討 論

人類及動物發(fā)育及成熟的關(guān)鍵時期，一般包括三個階段：胚胎期及新生兒發(fā)育期、青春期前后。胚胎期暴露于內(nèi)分泌干擾物，由于內(nèi)分泌干擾物具有可以穿過胎盤的特性（如DEHP等），會對胚胎造成不可逆的損傷，如可以造成雌雄比例改變；性別特征改變，主要表現(xiàn)為AGD及肛門生殖器指數(shù)（AGI）減小、乳頭保留、尿道下裂、隱睪和附睪發(fā)育不全等［2］，而一旦受損則往往會明顯影響到以后的解剖結(jié)構(gòu)、生理功能及行為，且很難逆轉(zhuǎn)。

以DEHP為代表的鄰苯二甲酸酯類在化學(xué)染料、個人護(hù)理用品及化妝品（指甲油、防曬霜、發(fā)膠、洗發(fā)水等）、醫(yī)療用品（輸液管、輸血袋等）中均大量存在，該類物質(zhì)常被用作聚氯乙烯塑料（PVC）的塑化劑，以增強(qiáng)彈性以及柔韌性。該類物質(zhì)可通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，并可在出生后經(jīng)乳汁及嬰兒用品進(jìn)入體內(nèi)［3，4］。流行病學(xué)調(diào)查示：臍血MEHP（DEHP代謝產(chǎn)物）水平與懷孕期縮短正相關(guān)，間接證據(jù)也提示該類物質(zhì)在圍生期發(fā)揮抗雄激素作用，同時母親尿液中DEHP代謝產(chǎn)物的濃度與嬰兒睪丸下降不全以及AGD降低正相關(guān)［5，6］。DEHP目前受關(guān)注最高，每年消耗量約有200萬噸以上，已成為全球最廣泛的污染物之一。

自2011年5月臺灣爆出“塑化劑風(fēng)波”，該類物質(zhì)引起廣泛關(guān)注。

植物性雌激素如染料木黃酮（Genistein，GEN）、黃豆苷元（Daidzein，DAI）等，因在食品中廣泛接觸，其對雄性生殖系統(tǒng)的影響亦引起廣泛的關(guān)注。有流行病學(xué)研究注意到大豆類食品因其含有的主要組分染料木黃酮，其攝入量增加往往出現(xiàn)精子密度下降，同時導(dǎo)致肛門生殖器距離（Anogenital distance，AGD）縮短，睪酮水平下降以及雄性雌性化等，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系［7，8］。同時有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)染料木黃酮低劑量可促進(jìn)頂體反應(yīng)以及睪酮分泌，高劑量則是抑制作用［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道低劑量染料木黃酮（2mg／kg BW）對氯氰菊酯（Cypermethrin）所致新西蘭大白兔精子質(zhì)量下降有改善作用。

目前對于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究，多集中于單種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物不同劑量對雄性生殖系統(tǒng)的影響，包括體外及體內(nèi)試驗(yàn)。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物合用的研究較少。而環(huán)境中接觸的環(huán)境雌激素并非單一，因而對兩種或多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物合用的研究亦是該領(lǐng)域的一個重點(diǎn)，可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在合用的情況下是否具有協(xié)同，疊加亦或是拮抗作用，從而為孕期暴露對雄性子代的生殖毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)較系統(tǒng)地研究了孕期母鼠暴露于單種及兩種常見內(nèi)分泌干擾物（DEHP及GEN）對子代雄鼠近期毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：孕期單一暴露于DEHP（250mg／kg）及GEN（400mg／kg）并未造成平均每窩活產(chǎn)只數(shù)、仔鼠只數(shù)、出生時性別比、子代雄鼠體重、AGD／體重1／3較對照組的顯著性變化。說明兩者孕期單一暴露對子代發(fā)育、性分化等無顯著影響。但其遠(yuǎn)期效應(yīng)值得進(jìn)一步觀察，特別是成年后生殖系統(tǒng)發(fā)育、生精功能及睪酮水平等。近幾年的研究證實(shí)：隱睪、尿道下裂與AGD減低有相關(guān)性［10］；圍生期母親尿液中PAEs代謝物與所生男嬰AGD減少有關(guān)，從而提示圍生期暴露于PAEs有去雄性化效應(yīng)（Demasculinizing effect）［11］。而AGD／體重1／3作為修正 AGI，可排除體重的影響，具有較高的敏感性，可以更好的反映去雄性化效應(yīng)。

孕期同時暴露于 DEHP（250mg／kg）及低劑量GEN（50mg／kg），子代雄鼠體重較對照組出現(xiàn)顯著下降，但平均每窩活產(chǎn)只數(shù)、仔鼠只數(shù)、出生時性別比、母鼠孕期體重變化等指標(biāo)較對照組的并無顯著性變化，AGD／體重1／3較對照組也未出現(xiàn)顯著性下降。說明在此暴露水平，已對子代雄鼠發(fā)育產(chǎn)生一定影響，但其遠(yuǎn)期效應(yīng)，包括睪酮水平，成年后生精功能值得進(jìn)一步觀察。

孕期同時暴露于 DEHP（250mg／kg）及高劑量GEN（400mg／kg），平均每窩活產(chǎn)只數(shù)、仔鼠只數(shù)、出生時性別比等指標(biāo)較對照組的亦無顯著性變化，AGD／體重1／3雖較對照組的亦無顯著性變化，但有下降趨勢，同時子代雄鼠體重較其余四組出現(xiàn)顯著性下降。說明兩者孕期同時暴露，對子代雄鼠發(fā)育造成較為明顯的影響，其效應(yīng)較 DEHP（250mg／kg）及高劑量GEN（400mg／kg）單一暴露亦出現(xiàn)明顯加重的傾向，較DEHP（250mg／kg）與低劑量GEN（50mg／kg）同時暴露更為明顯，提示 DEHP（250mg／kg）及高劑量GEN（400mg／kg）同時暴露存在著協(xié)同作用，其遠(yuǎn)期效應(yīng)如成年后睪丸、附睪、前列腺、精囊腺的發(fā)育，睪酮水平及睪酮合成相關(guān)基因的表達(dá)、睪丸下降情況等值得進(jìn)一步觀察。

本研究完成了不同劑量GEN與DEHP兩種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在孕期暴露對雄性子代系統(tǒng)發(fā)育方面研究的空白，為下一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。同時提示小劑量GEN與DEHP同時暴露，雄性化指標(biāo)有減弱趨勢，大量攝入GEN與DEHP暴露，雄性化指標(biāo)明顯減弱。同時有必要觀察其遠(yuǎn)期效應(yīng)，進(jìn)一步明確其生殖毒性，同時有必要從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)一步闡明機(jī)制。另外，由于種屬差異，我們的研究結(jié)果仍需要在其他種屬動物中進(jìn)一步重復(fù)進(jìn)而充分得到驗(yàn)證；同時，對于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的流行病學(xué)調(diào)查有必要深入開展，明確人群中暴露情況及對生殖系統(tǒng)影響。通過孕期暴露于兩種常見環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究，探討了單種和多種內(nèi)分泌干擾物暴露所致效應(yīng)的關(guān)系，同時為評估孕期暴露于內(nèi)分泌干擾物的安全性及風(fēng)險(xiǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的理論意義及臨床應(yīng)用前景。

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